周玲玲 袁冬平 张兴德 许 立 方泰惠

(南京中医药大学药学院 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210029)

原发性肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤，肝动脉栓塞术是目前临床采用的重要治疗方法之一〔1，2〕。采用药物微球经肝动脉介入，可栓塞至肝肿瘤的末梢动脉，具有栓塞和缓释药物的双重功能。由于肿瘤细胞具有周期性特点，联合用药远比单用一种药物效果要好，课题组尝试将抗肿瘤疗效确切的莪术油和丝裂霉素联合制成中西药复方制剂，进行了前期的制备工艺研究，研制成符合肝动脉栓塞要求的复方莪术油微球(CCAO- MS)制剂，并建立了大鼠移植性肝癌模型，初步证实了对肝癌的治疗作用，探讨了其部分机制〔3～6〕。本文进一步探讨其经肝动脉栓塞治疗大鼠移植性肝癌对肿瘤组织增殖和凋亡的调控机制。

1 材料与方法

1.1药品试剂、动物及细胞株 莪术油：橙黄色油状液体，由南京中医药大学药剂教研室提取；丝裂霉素：紫黑色粉末(无锡三和药业提供)；空白微球(B-MS)，CCAO-MS南京中医药大学药剂教研室提供，微球粒径为(72.01±7.65)μm，平均载药量为9.45%，体外药物释放符合一级释放模型。末端脱氧核苷酸转移酶介导化DUTP缺口末端标技技术(TUNEL)试剂盒(Roche 公司产品)。大鼠半胱氨酸天门氨酸蛋白酶(Caspase)-3一抗、增殖核抗原(PCNA)一抗、免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。SD大鼠，体质量200～300 g，雌雄各半；由南京中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号：SCXK(苏)2005-0018。大鼠Walker-256瘤株由南京中医药大学药学院陆茵教授惠赠。

1.2实验方法

1.2.1大鼠移植性肝癌模型的建立、分组和给药〔5，6〕SD大鼠，参照前期建立的方法复制大鼠移植性肝癌，成功复制的大鼠随机分为三组，每组15只，即： ①生理盐水组，肝动脉插管灌注0.2～0.3 ml生理盐水；②B-MS组，按10 mg/kg体重经肝动脉插管灌注；③CCAO-MS组，按10 mg/kg体重经肝动脉插管灌注。于瘤块移植后7 d，于胃十二指肠动脉上切一小口，以29 G胰岛素注射器上行进入肝固有动脉。按以上分组及剂量分别灌注相应制剂。灌注后结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的动脉夹。逐层缝合切口后外涂金霉素软膏，分笼饲养。于治疗7 d后处死动物，进行指标检测。

1.2.2肝肿瘤组织凋亡检测〔7〕每组各随机选取5个样本切片，采用TUNEL法检测肿瘤组织原位凋亡情况。光镜下观察切片的染色反应，以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。计数阳性细胞数并计算TUNEL阳性标记指数(TUNEL-LI)，即凋亡指数。TUNEL-LI=(表达阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.3PCNA的检测 标本同上切片处理，按照试剂盒说明书免疫组织化学法检测细胞PCNA的变化了解细胞增殖情况。

1.2.4肿瘤组织Caspase-3表达的检测 标本同上切片处理，采用免疫组织化学法，参照说明书进行。显微镜下观察，以细胞核或细胞质呈棕黄(褐)色为阳性细胞，各样本进行评分0～3分：0分：阴性表达；1分：轻度表达；2分：中度表达；3分：重度表达。

2 结 果

2.1CCAO-MS对移植性肝癌大鼠肝肿瘤细胞凋亡的影响 经肝动脉灌注CCAO-MS后肝肿瘤凋亡明显增多，细胞核内及少数胞质内出现棕色颗粒，凋亡细胞散在分布，细胞核固缩或正常，凋亡指数〔(33.4±7.37)%〕明显高于生理盐水组〔(3.62±1.75)%〕和B-MS组〔(5.92±2.04)%〕(P<0.01)。见图1。

2.2CCAO-MS对移植性肝癌大鼠肝肿瘤表达PCNA的影响 生理盐水组大鼠肝脏肿瘤组织PCNA表达较强；复方莪术油微球组大鼠肝脏内瘤组织内PCNA表达较弱。见图2。

生理盐水组 B-MS组 CCAO-MS组

生理盐水组 B-MS组 CCAO-MS组

2.3CCAO- MS对移植性肝癌大鼠肝肿瘤表达Caspase-3的影响 生理盐水组大鼠肝脏肿瘤组织Caspase-3表达(0.20±0.45)较低；CCAO-MS组(2.60±0.55)大鼠肝脏肿瘤组织内表达较B-MS组(0.60±0.55)及生理盐水组增强(P<0.01)。见图3。

生理盐水组 B-MS组 CCAO-MS组

3 讨 论

CCAO-MS制剂采用莪术油和MMC两种药物联合应用，莪术是活血化瘀药，其抗肿瘤作用受到广泛关注，而且其可促进其他抗肿瘤药物的吸收〔8〕；MMC具有非特异作用于肿瘤细胞增殖各个时期的特点。制成微球制剂肝动脉灌注给药，针对性强，抗肿瘤同时可减少全身不良反应，课题组前期完成了CCAO-MS的制备工艺研究，并采用Walker-256瘤株成功复制了大鼠移植性肝癌模型，在此基础上证实了其治疗大鼠移植性肝癌较单用莪术油和MMC具有增效减毒作用〔4，5〕。

肿瘤的发生发展与细胞凋亡受阻密切相关，肿瘤组织除了增殖活性以外，同时还存在细胞凋亡。对于具有同等增殖能力的肿瘤而言，如果细胞凋亡率减少，将使肿瘤细胞净生长率提高，预后则更差〔9，10〕。研究显示CCAO-MS可阻滞肿瘤细胞SMMC-7721细胞株的细胞周期而抑制其增殖，并可促进肿瘤细胞的凋亡〔6〕，在此基础上，本研究进一步观察了CCAO-MS对移植性肝癌大鼠的肝肿瘤细胞的凋亡过程的影响。结果显示：复方微球可明显促进肝肿瘤细胞的凋亡，说明其可在肝脏肿瘤组织内发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而进一步抑制其肿瘤组织的生长速度，这可能是其治疗肝癌的机制之一。

细胞的增殖和凋亡涉及一系列基因的激活、表达及调控，在此过程中，PCNA、Caspase家族等均发挥了不同的作用〔11，12〕。PCNA是反映肿瘤细胞增殖活性的良好指标，而Caspase-3为关键的凋亡分子，在细胞凋亡早期的启动与执行过程中起着重要作用〔13〕。本结果提示CCAO-MS的抗肿瘤作用可能与下调PCNA的表达和上调Caspase-3的表达有关。

综上，CCAO-MS经肝动脉栓塞对大鼠移植性肝癌有明显的治疗作用，且可调控肿瘤增殖与凋亡的相关基因，其采用中西药合用，较单用中药和西药均有独特的优势，具有良好的应用前景。

4 参考文献

1王 军，刘德慧，郑江涛，等.原发性肝癌临床治疗研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(3)：429-31.

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3张兴德，郁红礼，周玲玲，等.正交法筛选莪术油微球制备工艺〔J〕.南京中医药大学学报，2007；23(5)：304-6.

4施华平，周玲玲，马 健.复方莪术油微球肝动脉栓塞对大鼠移植性肝癌的治疗作用〔J〕.上海中医药大学学报，2009；23(5)：58-61.

5周玲玲，袁冬平，张 良，等.复方莪术油微球肝动脉栓塞对大鼠移植性肝癌的增效减毒作用〔J〕.南京中医药大学学报，2010；26(6)：447-50.

6杨 娟，周玲玲，袁冬平，等.联用莪术油和丝裂霉素对肝肿瘤细胞株SMMC-7721的作用研究〔J〕.安徽医药，2009；13(11)：1327-8.

7陈绪军，肖 琦，艾中立，等.肝细胞损伤，细胞凋亡及肝细胞保护〔J〕.国外医学·外科学分册，2000；27(1)：212-24.

8吴伟忠，刘康达，汤晓雷，等.β-榄香烯诱导的抗肿瘤免疫保护作用机理初探〔J〕.中华肿瘤杂志，1999；21(6)：405-8.

9Tak HC,Tony KH,Keith WK,etal.Appotosis-related proteins in cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma of the cervix〔J〕.Gynecol Oncol,2002;86(1):14-8.

10Evan G,Little WT.A matter of life and cell death〔J〕.Science,1998;281(5381):1317- 22.

11Salvesen GS,Dixit VM .Caspase:intracellular signalling by proteolysis〔J〕.Cell,1997;91(4):443-6.

12Borner C,Martinou I,Mattmann C,etal.The protein bcl-2 alpha does not require membrane attachment but two conserved domains to suppress apoptosis〔J〕.Cell Biol,1994;126(4):1059-68.

13Sacco R,Tsutsumi T,Suzuki R,etal.Antiapoptotic regulation by hepatitis C virus core protein through up-regulation of inhibitor of caspase-activated DNase〔J〕.Virology,2003;317(1):24-35.