王桂芬 陈珏晓 侯正平 张鹏霞

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

氧化损伤与衰老、Alzheimer病(AD) 、脑动脉粥样硬化〔1,2〕等密切相关，氧化应激是这些疾病致病的根本原因。研究氧化应激对基因表达的调控作用, 探索抗氧化系统对细胞的保护途径, 对于预防、抵制这些相关疾病的发生发展以及预防衰老等有重要意义。研究表明〔3,4〕，黄芪具有抗氧化作用。但黄芪主要成分是否能有效抑制氧化应激所致的人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)细胞损伤，尚未见报道。本研究探讨黄芪总黄酮(AF)和黄芪甲苷(Astr)对MRC-5细胞氧化应激损伤的保护作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 胎牛血清和MEM培养基购自Hyclone公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购于 Sigma 公司；流式试剂盒购自BD公司；鼠抗人Trx和 Ref-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司; 山羊抗鼠IgG购于博士德生物公司； 硝酸纤维素(NC)膜、四甲基乙二酸(TEMED)、过硫酸胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250、小牛血清白蛋白(BSA)购于Amresco公司；Trizol、RT-PCR试剂盒购于宝生物公司。MRC-5细胞购自中国科学院上海生物学研究细胞库。

1.2方法

1.2.1细胞培养和处理 使用含10%BSA的MEM培养基(含 100 g/ml氨苄青霉素, 100 g/ml链霉素)，置37℃ CO2细胞培养箱培养。取第28代对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2H2O2诱导MRC-5细胞凋亡所需浓度和时间的确定 采用 MTT 法定量检测细胞的活性。MRC-5细胞以7×104个/ml的密度接种于96孔板。细胞分11 组：对照组常规培养细胞，空白组仅加入相同体积的培养基；8个H2O2损伤组，每组 6 个复孔，细胞培养至对数生长期后加入H2O2至终浓度分别为200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μmol/L，分别孵育6、12、24 h 后，加入 5 mg/mL的 MTT 液(10 μl/孔)，继续培养4 h。丢弃孔内培养液加入 DMSO 液(150 μl/孔)。室温下，振荡 10 min，使用酶标仪于 570 nm 波长处检测各孔 OD值。计算细胞存活率。细胞存活率=(OD用药组-OD空白) / (OD对照-OD空白)

1.2.3AF、Astr和药物浓度的确定 采用 MTT 法定量检测细胞的活性。第一组为对照组常规培养细胞；空白组相同体积的培养基；第二组为H2O2组常规培养细胞并使H2O2的终浓度为700 μmol/L； 第三组37℃培养至细胞到对数生长期后将AF(5、10、20、40 mg/L)和Astr(5、10、20、40 mg/L)分别加入不同孔板中，加入H2O2使终浓度为700 μmol/L，继续于 37℃培养24 h后，MTT 法检测570 nm 波长处检测各孔 OD值。

1.2.4RT-PCR检测无嘌呤/无密啶核酸内切酸/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)和Trx mRNA基因的表达 采用RT-PCR试剂盒提取细胞总RNA，逆转录成cDNA。APE/Ref-1基因上游引物5′-CAAAGAGGCAGCAGGAGA -3′，下游引物5′-CAAATTCAGCCACAATCAC-3′，扩增片段长度386 bp。Trx基因上游引物 5′- ATTTCCATCGGTCCTTAC-3′，下游引物5′-CAACTGGGTTTATGTCTTC -3′，扩增片段长度461 bp。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，上游引物5′-AATCCCATCACCATCTTCC-3′，GH IYTBXH TR ：5′-CATCACGAAACAGTTTCC-3′，扩增片段长度382 bp。PCR扩增体系：5倍缓冲液5 μl， Taq酶0.125 μl，APE/Ref-1的上下游引物(10 μmol/L)各0.25 μl，cDNA 2 μl，加双蒸水至25 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，最后72℃延伸7 min，终止反应。Trx的退火温度为48℃，其他反应条件同上。GAPDH的退火温度为54℃，其他的反应条件同上。PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察并成像。

1.2.5Western印迹检测APE/Ref-1和Trx蛋白的表达 倒掉细胞培养液，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次，加入裂解液在冰上裂解30 min。收集细胞离心(12 000 r/min，4℃)5 min，收集上清，用紫外分光光度计检测蛋白浓度和纯度。按蛋白含量测定结果每孔上样 80 μg，蛋白样品经 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分离后, 转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 用含 3% BSA的TBST(10 mmol/L Tris，0.05% Tween，0.85% NaCl)对PVDF膜进行封闭，一抗是鼠来源的单克隆抗体(1∶1 000 稀释)4℃孵育过夜，TBST洗3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗3次。化学发光法(ECL)显影。

1.2.6流式细胞术检测MRC-5细胞早期凋亡情况 药物处理细胞后，胰酶消化吹打离心，冷PBS洗细胞2次。1倍上样重悬细胞让细胞数为1×106/ml。取100 μl加5 μl的PE AnnexinⅤ和5 μl的7-AAD。轻柔混匀，25℃暗箱孵育15 min后加100 μl的1倍上样缓冲液上机。实验均重复3次。

1.2.7免疫荧光检测8-OHdG的表达 细胞爬片，药物处理细胞后，PBS洗3次，丙酮固定细胞15 min，PBS洗3次，用BSA封闭液覆盖标本，37℃孵育1 h。加一抗4℃过夜，第2天37℃复温1 h。PBS洗3次，加异硫氯酸荧光素(FITC)标记的二抗37℃避光孵育2.5 h，PBS洗3次封片镜检。

2 结 果

2.1MTT测定结果 800 μmol/L H2O2孵育 24 h可显著诱导 MRC-5 细胞损伤，使细胞存活力下降至47.25%。建立了细胞氧化损伤模型。见图1。

2.2AF和Astr对MRC-5细胞存活率的影响 Af最佳抗氧化浓度为10 mg/L，Astr为10 mg/L，其细胞存活率与模型组有显著差异。见图2。

2.3RT-PCR检测APE/Ref- 1和Trx mRNA的表达情况 AF+ H2O2、Astr+ H2O2组比H2O2组APE/Ref-1和Trx mRNA表达明显升高(P<0.01)，而H2O2组与对照组相比表达明显降低(P<0.01)。见图3。

图1 不同浓度的H2O2作用于MRC-5细胞不同时间对细胞损伤的影响

1～4分别为AF+H2O2组、Astr+H2O2组、H2O2组、对照组；与H2O2组比较：1)P<0.01；下图同

M：DL2000 DNA Marker

图3 AF和Atrs对APE/Ref-1和Trx mRNA表达影响

2.4MRC-5细胞APE/Ref-1蛋白表达 H2O2使 MRC-5细胞的APE/Ref-1蛋白表达显著降低，AF+H2O2和Astr+H2O2组促进MRC-5细胞的APE/Ref-1和Trx蛋白表达。见图4。

2.5MRC-5细胞早期凋亡情况 MRC-5的早期凋亡率为20.700 0%±2.206 8%；AF+ H2O2组凋亡率为4.400 0%±1.931 3%；Astr+ H2O2组凋亡率为5.800 0%±1.777 6%；对照组细胞凋亡率为1.633 3%±0.896 3%。结果这两种药物可明显减轻H2O2对MRC-5细胞的凋亡诱导作用(P<0.05)。

图4 Western印迹检测APE/Ref-1和Trx蛋白表达

2.6免疫荧光检测8-羟化脱氧乌苷(8-OHdG)的表达 H2O2组MRC-5的8-OHdG荧光强度为0.984 6±0.150 3；AF+ H2O2组的8-OHdG荧光强度为0.568 5±0.020 5；Astr+ H2O2组的8-OHdG荧光强度为0.638 0±0.042 4；对照组8-OHdG荧光强度为0.540 0±0.129 5。药物可明显减轻H2O2对MRC-5细胞的氧化损伤作用(P<0.05)。

3 讨 论

体外培养的细胞衰老模型,可用于阐述器官衰老内在机制,同时细胞衰老也可以被不同的应激因素诱导,包括氧化应激。H2O2是一种较强的氧化剂，能穿透细胞膜，通过Haber-Weiss 或 Fenton 反应，形成高活性的自由基如单态氧、羟自由基等活性氧簇(ROS)，ROS广泛攻击膜磷脂、膜蛋白、胞质蛋白和DNA,导致细胞的氧化应激损伤〔5〕。ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子时,可生成氧化性加合物8-OHdG, 从而使DNA链空间结构改变。碱基配对时8-OHdG与腺嘌呤A配对, 导致DNA链G∶C→T∶A颠换。这种突变难以修复或修复极慢, 常常是ROS引起突变、诱发癌症过程中的重要事件。因此, 8-OHdG已被广泛用于实验和临床中, 参与氧化应激与病变的指标检测与机制分析。

ROS对DNA的损伤最终产生AP位点，抑制mRNA和DNA 的合成，作为非编码病变导致DNA突变增加。APE能控制许多转录因子的活性包括Fos和Jun, DNA通过催化反应切断5′磷酸二酯键除去无碱基位点，毗邻到一个AP位点。硫氧还蛋白和APE/Ref-1对正常组织细胞有抗氧化应激损伤作用，发挥细胞保护作用，使细胞免于氧化应激的损伤，APE/Ref-1的氧化还原修饰由TRX完成，后者通过直接作用使APE/Ref-1还原，并与之形成异二聚体复合物。TRX必须由胞质易位至核内才能与APE/Ref-1反应，其作用由Cys32和Cys35完成；而APE/Ref-1的靶残基可能为Cys65和Cys93，因为它们对氧化还原敏感。紫外线、HO-均可使TRX易位。APE/Ref-1与TRX作用增强了APE/REF-1介导的AP-1和p53对DNA的特异结合，促使它们发挥转录因子的作用。

细胞氧化损伤时APE /Ref-1和Trx的表达降低，而Trx蛋白是非常有效的单线态氧淬灭剂和羟自由基清除剂〔6〕，修复损伤蛋白质(将二硫键还原为巯基)参与细胞氧化还原调节的耦联通路〔7,8〕：NADPH-硫氧还蛋白(Trx)-APE /ref-1-氧化/还原调节的转录因子(AP-1、NF-κB、Egr-1、HIF-1α、HLF、Pax-5、Pax-8、p53等)，而且转录因子AP-1、NF-κB、P53、HIF-1激活的一些靶基因表达出刺激一些对细胞具有保护作用的蛋白质合成〔9〕。

现代药理学研究证实，黄芪具有增强人体免疫功能、抗辐射、抗疲劳、抗炎及抗病毒等作用〔10〕，长期服用黄芪可以预防老年性动脉硬化。周鹏〔11〕研究发现黄芪处理衰老大鼠脑模型后，可使超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，谷脱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性也增加，丙二醛(MDA)含量降低，证明黄芪抗衰老可能是通过促进自由基的清除来完成。

本文成功地建立了H2O2导致MRC-5细胞氧化应激损伤的细胞模型；并且结果表明，AF和Astr能够抑制氧化损伤细胞的APE/Ref-1表达降低。由此推测AF、Astr和AP可能增加了Trx的活性，进而激活APE/Ref-1，通过DNA修复作用与氧化还原作用抑制细胞凋亡来实现对MRC-5细胞保护作用。

4 参考文献

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