宋秋颖 张增雷 张 伟 潘艳明 任凤云 冯玉宽

(牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

血管和淋巴管新生的程度是实体肿瘤无限增殖、复发和转移潜能大小的直接影响因素之一，更是肿瘤细胞自给式生长的重要机制之一，同时亦是包括肺癌在内的许多恶性肿瘤的主要恶性表型之一〔1,2〕。目前，多数实体肿瘤的靶向治疗就是基于阻断血管和淋巴管新生理论产生的。尽管如此，实体瘤血管和淋巴管新生在分子水平调控机制并不十分清楚。本研究以血管内皮生长因子(VEGF)-C为靶点，研究通过RNA干扰技术沉默A549细胞VEGF-C 基因表达对VEGF家族因子及其受体和下游信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1细胞株及主要试剂 人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，细胞起源于美国模式培养物集存库(ATCC),用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养(美国Invitrogen 公司)。PSIH1-H1-copGFP shRNA Vector及慢病毒载体系统为美国System Biosciences公司产品;TRIzol 试剂、内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 连接酶、反转录试剂盒及感受态细胞购于大连TaKaRa公司;抗VEGF-C、 VEGF-A、VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2抗体购于美国Santa Cruz公司，p-VEGFR-3、p-ERK1/2、p-AKT、p-p38、ERK1/2、AKT、p38、GAPDH 抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，二抗均购于美国Santa Cruz公司，蛋白提取试剂、蛋白定量试剂盒及ECL发光试剂盒购于美国Pierce公司，PVDF膜购于美国Millipore 公司;ELISA检测试剂盒Quantikine Human VEGF-C Enzyme-Linked Immunoassay 购于美国R&D公司。

1.2构建靶向VEGF-C 基因的干扰质粒pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C 根据VEGF-C(NM005429) mRNA 序列信息，使用siRNA Target Finder在线siRNA序列设计软件，设计针对其CDS 区的siRNA 序列:5′- CCTCAGCAAGACGTTATTT -3′，根据siRNA序列，设计两条互补的DNA模板单链，模板链包括siRNA的正义链和反义链，中间以12个脱氧核苷酸的Loop结构(5′-CTTCCTGTCAGA-3′)相连，后面接有RNA PolyⅢ聚合酶转录终止位点(TTTTT)，同时模板链两端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，退火形成互补双链DNA。pSIH1-H1-copGFP shRNA 质粒双酶切后与上述退火产物连接，连接产物转化TOP10 感受态细菌，37℃过夜培养。挑取单菌落接种LB 培养基，37℃、300 r/min摇床培养16 h，提取pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C质粒，测序并进行序列分析。

1.3重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C的包装和生产 使用含10% FBS的DMEM培养液培养293TN细胞(System Biosciences，Cat. # LV900A-1)，0.6 ml胰酶消化传代，取对数生长期细胞接种至10 cm贴壁细胞培养皿上，每皿接种数目为1.5×106个，接种24 h后，细胞贴壁密度约为85%，细胞梭型，中央发亮，形态饱满，适合转染实验。使用LipofectamineTM 2000 转染试剂转染，质粒用量为Lentivirus Package plasmids mix(500 ng/μl)，22 μl；Lv-VEGF-C siRNA plasmid DNA(500 ng/μl)，4 μl；转染试剂用量每10 cm培养皿为40 μl。转染后48 h，镜下观察细胞液发黄，贴壁细胞密度约为90%，细胞扁平，贴壁状态较好。收集细胞上清，5 000 r/min离心5 min，去掉细胞碎片沉淀，然后使用0.45 μm的PVDF膜过滤上清液，冰浴条件下过夜保存；梯度稀释法进行重组慢病毒滴度测定，使用dPBS(pH7.8,实验室配制)将病毒颗粒浓度调整至1×104ifu/μl，按1 ml每管浓度调整后的病毒液进行分装，-70℃保存待用。所收集的病毒分别命名为Lv-siRNA-VEGF-C组和Lv-Con(空载质粒组)。

1.4重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549细胞 接种处于对数生成长期的A549细胞到96孔细胞培养板，每孔1.0×104个细胞，分别加入100、50、40、30、20、10 μl标准copGFP标记的病毒液(1×104ifu/μl)感染A549细胞，换液后72 h，荧光倒置显微镜下观察，绿色荧光表达比较稳定，使用胰酶消化的方法对细胞进行计数，进行数据分析，确定细胞感染效率达到100%时最少病毒用量，计算最佳MOI 值。按照最佳MOI添加病毒液，同时设Lv-Ctrl 组和未转染组，37℃和5% CO2的条件下正常培养。放大培养细胞克隆，挑取最稳定的克隆进行传代培养，并且收集不同代数的细胞进行Western印迹检测。

1.5Western印迹法检测细胞VEGF-C及VEGF家族因子和信号通路的蛋白表达 分别收集Lv-siRNA-VEGF-C细胞和对照组细胞1.5×106个，加入4℃预冷的蛋白裂解液充分裂解，4℃条件下12 000 r/min 离心15 min，收集上清使用BCA法进行总蛋白浓度检测。进行SDS-PAGE电泳，转膜，常温封闭2 h，TBST 缓冲液冲洗2遍，分别加入VEGF-C,VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3,pVEGFR-2,p-VEGFR-3,p-ERK1/2,p-AKT,p-p38,ERK1/2,AKT,p38,GAPDH一抗，4℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入二抗后室温反应1 h;TBST 洗膜3次，每次10 min。曝光、显影、漂洗、再定影。采用灰度扫描软件TotalLab进行胶片扫描，分析检测结果。

1.6ELISA法检测细胞VEGF-C蛋白的分泌 取96孔培养板培养细胞上清液，每孔取100 μl，4℃和3 000 r/min离心2 min，去除细胞碎片。加入100 μl of Assay Diluent RD1W。然后分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加入待测上清液50 μl，使用封板膜封板后置室温摇床500 r/min条件处理2 h；使用Wash Buffer洗板4次，无菌吸水纸上倒置拍板，尽量甩出孔中残留的洗液；每孔加入200 μl VEGF-C Conjugate，使用新的封板膜重新封板，室温500 r/min摇床处理；每孔添加200 μl Substrate Solution,室温避光孵育30 min；每孔加终止液50 μl Stop Solution，终止反应。以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。

2 结 果

2.1重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 成功感染A549细胞 对重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C测序结果表明，插入片段与设计的VEGF-C shRNA核苷酸序列完全一致，未发现有突变、缺失、插入等异常存在，表明已经成功构建靶向VEGF-C 基因的重组慢病毒载体Lv-siRNA-VEGF-C。将重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549细胞，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549 细胞的效率达90%(图1)。

图1 重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549细胞(×200)

2.2重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染下调A549细胞中VEGF-C蛋白的表达和分泌 慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染后，A549 细胞中VEGF-C 蛋白的表达量明显降低。与未感染组A549细胞相比，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染后，A549细胞中VEGF-C 蛋白的表达水平〔( 0.23±0. 02) vs( 0.54±0.03),P<0.01〕和72 h的蛋白分泌水平〔(764.90±204.33) pg/ml vs (3 355.06±256.93) pg/ml〕明显降低。见图2。

1)P<0.05，2)P<0.01

2.3重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549细胞VEGF家族因子及其受体的表达 与未转染的A549细胞相比，VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3的蛋白表达在Lv-siRNA-VEGF-C细胞中明显减少，分别减少了61.77%、57.30%和73.75%(P<0.001)。见图3。

图3 重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549细胞VEGF家族因子及其受体的表达

2.4重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549细胞VEGFRs磷酸化水平ERK、AKT和p38信号通路活性 VEGF-C RNA干扰可显著降低VEGFR-2和VEGFR-3磷酸化水平，同时也降低了VEGFR-2和VEGFR-3介导的ERK1/2，AKT和p38-MAPK信号通路的磷酸化水平。见图4。

图4 重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549细胞VEGFRs磷酸化水平和ERK、AKT和p38信号通路活性

3 讨 论

在众多调控因子中，VEGF-A、VEGF-C及其受体VEGFR-2和VEGFR3是肿瘤发生发展过程中，血管和淋巴管生成的主要因子，已经成为以病理性血管和淋巴管生成信号通路为标靶的肿瘤靶向治疗的首选标靶〔3〕。近期的研究发现，VEGF-C及其受体VEGFR-3表达于许多恶性肿瘤细胞，并且证实许多肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移与VEGF-C和VEGFR-3组成的自分泌信号轴相关，而且VEGF-C除了传统认为的参与肿瘤淋巴管生成之外，还是肿瘤增殖、侵袭和转移的关键因子，具有多重生物学作用〔4，5〕。 本研究发现RNA干扰沉默VEGF-C基因表达可明显抑制VEGF-C和VEGFR-3的表达，并同时抑制了VEGF-A和VEGFR-2的表达，而VEGF-A和VEGFR-2则是调控血管生成的关键信号轴。因此，VEGF-C与VEGF家族因子和受体之间存在着自分泌调控关系，这将为肿瘤侵袭和转移的生物学特征提供新的实验支撑材料。VEGF-C/VEGFR-3和VEGF-A/VEGFR-2信号轴分别被认为是调控淋巴管和血管生成的关键因素，因此，干扰VEGF-C基因的表达同时阻断了上述两条信号轴，那么，是否通过抑制VEGF-C基因表达可同时抑制肿瘤的血管和淋巴管生成，还有待进一步的实验研究和证实。

许多研究显示，AKT、ERK和p38信号分子的磷酸化是调控细胞增殖和生存的关键步骤。亦有研究显示，通过抑制ERK和AKT信号通路可具有抑制肝癌发生发展和具有抗肿瘤血管生成作用〔6〕。在内皮细胞，VEGFRs介导的AKT、ERK和p38信号通路的激活已被广泛认知。然而，在肿瘤细胞，VEGFRs介导的AKT、ERK和p38信号通路如何被激活及如何起作用少有报道。Morelli等〔7〕的研究证实，在胃肠肿瘤细胞，VEGFR抑制剂可抑制VEGFR的磷酸化水平，并且同时抑制了下游信号分子AKT和ERK的磷酸化水平。Svensson等〔8〕在乳腺癌细胞则发现ERK的磷酸化与VEGFR-2的表达相关。在肺癌细胞，Su等〔3〕发现人为去除VEGFR-3的激酶活性会导致p38MAPK的磷酸化水平降低，而不影响ERK的磷酸化水平。本研究显示，RNA干扰沉默VEGF-C基因表达可同时明显抑制AKT、ERK和p38信号分子的磷酸化活性，这将导致AKT、ERK和p38信号通路同时受到阻滞，进而抑制了上述信号通路在肿瘤细胞增殖、凋亡和血管、淋巴管生成方面发挥作用。

4 参考文献

1Kerbel RS. Tumor angiogenesis〔J〕. N Engl J Med,2008;358:2039-49.

2Feng Y,Wang W,Hu J,etal. Expression of VEGF-C and VEGF-D as significant markers for assessment of lymphangiogenesis and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer〔J〕. Anat Rec(Hoboken),2010;293:802-12.

3Su JL,Yang PC,Shih JY,etal.The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells〔J〕. Cancer Cell,2006;9:209-23.

4Li D,Xie K,Ding G,etal.Tumor resistance to anti-VEGF therapy through up-regulation of VEGF-C expression〔J〕. Cancer Lett,2014;346:45-52.

5Kerbel RS. Tumor angiogenesis:past,present and the near future〔J〕. Carcinogenesis,2000;21:505-15.

6Huynh H. AZD6244(ARRY-142886) enhances the antitumor activity of rapamycin in mouse models of human hepatocellular carcinoma〔J〕. Cancer,2010;116:1315-25.

7Morelli MP,Brown AM,Pitts TM,etal.Targeting vascular endothelial growth factor receptor-1 and-3 with cediranib(AZD2171):effects on migration and invasion of gastrointestinal cancer cell lines〔J〕. Mol Cancer Ther,2009;8:2546-58.

8Svensson S,Jirstrom K,Ryden L,etal.ERK phosphorylation is linked to VEGFR2 expression and Ets-2 phosphorylation in breast cancer and is associated with tamoxifen treatment resistance and small tumours with good prognosis〔J〕. Oncogene,2005;24:4370-9.