陈阳霞 顾桉菁 梁宇恒 马团 席丽艳

(1.中山大学孙逸仙纪念医院，广州 510120;2.贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004)

马尔尼菲青霉是一种双相型真菌，室温培养时以菌丝形态生长，37℃培养或感染人体后以酵母细胞形态生长，感染人体后可引起一种严重的深部真菌病，该病在免疫受损患者尤其是HIV感染患者中多见［1］。有研究表明，马尔尼菲青霉的致病性与acuD、hsp 70和hsp 90等基因有关［2-4］。通过克隆目的基因并将其连接到真核表达载体，转化入真核细胞，是研究真核细胞基因功能常用的方法。丝状真菌常用的转化方法有原生质体法、醋酸锂法、农杆菌介导法、电穿孔法和生物弹道技术等。其中最常用的是原生质体法，关键是要用蜗牛酶、纤维素酶等消化细胞壁。但是制备原生质体时，因不同时间配制的酶解液在浓度或性能上有所差异，导致原生质体的形成速度不同，所以每次制备过程都需多次观察且不容易控制。利用生物弹道技术转化，则首先要用钨对质粒DNA进行包装，再通过高速离子轰击将其转化入孢子和菌丝［5］。直接使用萌发孢子进行电穿孔转化，则不需制备原生质体。电穿孔转化法原理是瞬时电击导致细胞膜形成可逆的通透性，形成微孔通道，从而使质粒DNA进出细胞获得转化［6］。有研究表明，电穿孔转化法转化率较原生质体法高，且大部分转化子都是单拷贝，在基因组随机分配，更适合丝状真菌的转化［7］。该方法已在多种丝状真菌中得到应用，如烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等［8］。在本研究中，直接使用萌发的马尔尼菲青霉孢子进行电穿孔转化，从孢子龄、孢子萌发时间、质粒浓度和电场强度等方面考察各个因素对电穿孔转化效率的影响，期望得到关于马尔尼菲青霉高效转化方法。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株和载体 马尔尼菲青霉缺陷株SPM4(pyrG-，niaD-)和质粒pALX223(克隆含构巢曲霉pyrG基因)均为北京大学医学真菌和真菌病研究中心惠赠。

培养基 培养携带质粒pALX223的重组大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α，使用含 100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。真菌培养基:PDA+U培养基，EP+U培养基、SDB液体培养基、蔗糖SD培养基和SD培养基。具体配制方法参考文献［9］。

主要试剂 内切酶XhoI和BamHI购自Thermo Scientific公司、质粒中提试剂盒购自Promega公司、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根公司。

主要仪器 Eppendorf高速冷冻离心机、Leica DM2500相差显微镜和成像系统、Bio-Rad gene pulser II电穿孔仪等。

1.2 质粒的提取、酶切和回收

使用含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基复苏和扩大培养携带质粒pALX223的重组大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。将扩大培养的菌液按照Promega公司质粒中提试剂盒说明书 (编号CTM253)依次经过裂解产物制备、DNA纯化、洗涤、洗脱等步骤提取质粒并测OD值;取适量质粒按Thermo Scientific公司内切酶XhoI和BamHI说明书制备酶切体系;最后按照北京天根公司大量琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒说明书 (目录号DP210)依次经过跑胶、切胶、溶胶等步骤对酶切后目的DNA进行回收。

1.3 感受态孢子的制备

用无菌水从PDA+U斜面上洗下26℃培养一定天数的SPM4孢子，接种于EP+U培养基，使孢子浓度达到106个/mL，于37℃，150 r/min条件下培养一定时间使孢子萌发，期间每隔1 h收集部分孢子悬液并取样显微镜观察孢子形态，将各个时间点收集的孢子悬液用冰预冷1M山梨醇洗涤3次制备感受态孢子并将其调整至107个/mL，置冰上备用。

1.4 转化

冰上取60 μL SPM4感受态孢子悬液，加入一定量的质粒DNA和无菌水，使终体积为70 μL，同时设一组不加质粒DNA的阴性对照。混合物在冰上放置15 min后转入0.2 cm电击杯中，在一定电场强度下电击。电击后立即加入930 μL 1M冰预冷山梨醇，冰上放置30 min后加入2 mL SDB液体培养基，37℃，150 r/min培养90 min。离心去上清(留100 μL)涂布于蔗糖SD培养基，26℃培养5～7 d后挑取生长出的单菌落进行纯化。

1.5 转化子的筛选和纯化

使用SD培养基进行筛选和纯化。挑取单菌落点种SD培养基进行产孢培养，无菌水洗下相应转化子的孢子，稀释后涂布于上述筛选平板，挑取单菌落再进行第二次产孢培养和稀释涂布。若该单菌落两次产孢培养均可正常生长，则将其所对应的转化子记为阳性转化子，余记为阴性。具体方法参考文献［10］。

1.6 统计学处理

考察孢子龄、孢子萌发时间、质粒浓度、电场强度和质粒线性化对电转化效率影响时，各个组合进行3次生物学重复，使用Microsoft Excel记录各个组合各次实验的阳性转化子数并将其导入Graph-Pad Prism 5软件制图，数据描述以均数±标准差表示，使用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，两组均数比较采用 Student＇s t-test(*.P＜0.05;＊＊.P＜0.01)。

2 结 果

2.1 孢子龄对转化率的影响

收集培养5～9 d的SPM4孢子。其他条件为:孢子萌发时间 4 h;电场强度 5 kV/cm;环状pALX223质粒1 μg。由图1知，当孢子龄为6 d时，获得的转化子数达到峰值，使用培养6 d的孢子可获得最高的转化率。

2.2 孢子萌发时间对转化率的影响

收集培养6 d的SPM4孢子，光镜下观察不同时间的孢子形态，由图2知，随着萌发时间的增加，孢子有逐渐聚集的趋势，3 h部分孢子开始萌发，4 h孢子基本萌发，5 h部分孢子已有菌丝生成和聚集。其他条件为:电场强度 5 kV/cm;环状pALX223质粒1 μg。由图3知，当孢子萌发4 h，获得的转化子数达到峰值，使用萌发4 h的孢子能获得最高的转化率。

2.3 电场强度对转化率的影响

在4.0～7.5 kV/cm范围内利用不同的电场强度电击［7，11］，观察其对马尔尼菲青霉转化率的影响。其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;环状pALX223质粒1 μg。由图4知，使用5 kV/cm的电场强度可获得最高的转化效率。

2.4 质粒量对转化率的影响

利用不同量的环状pALX223质粒DNA对SPM4进行转化。其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;电场强度5 kV/cm。由图5知，转化子数随质粒量的增加而增加，当加入质粒量达到1 μg时，转化子数增加趋势趋于平缓，加入质粒量增加至2 μg时转化子数基本不再增长，加入1～2 μg的质粒DNA可获得较高的转化效率。

2.5 质粒线性化对转化率的影响

分别使用1 μg环状或线性化pALX223质粒DNA转化SPM4，以研究质粒线性化对转化率的影响。其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;电场强度5 kV/cm。由图6知，使用环状pALX223质粒DNA平均获得转化子21个，而使用XhoI和BamHI酶切线性化的pALX223质粒DNA平均获得转化子13个，环状质粒较线性化质粒转化率高(＊＊.P＜0.01)。

图1 孢子龄对SPM4转化率的影响(其他条件为:孢子萌发时间4 h;电场强度5 kV/cm;环状pALX223质粒1 μg) 图2 不同萌发时间SPM4孢子光镜下形态(400×) 图3 孢子萌发时间对SPM4转化率的影响(其他条件为:孢子龄6 d;电场强度5 kV/cm;环状pALX223质粒1 μg) 图4 电场强度对SPM4转化率的影响(其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;环状pALX223质粒1 μg) 图5 质粒量对SPM4转化率的影响(其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;电场强度5 kV/cm) 图6 环状或线性化质粒对SPM4转化率的影响(其他条件为:孢子龄6 d;孢子萌发时间4 h;电场强度5 kV/cm)。注:柱状图中柱形代表3次独立实验的平均值 (＊＊.P＜0.01)Fig.1 Effect of spore stadium on transformation frequency of SPM4.Other conditions:germination time 4 h，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.2 Microscopic morphology of germinated spores of SPM4 at different time(400 × )Fig.3 Effect of germination time on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.4 Effect of electric field intensity on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.5 Effect of plasmid amount on transformation efficiency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm Fig.6 Effect of circular or linearized plasmids on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm.The bars are representative of the mean values of three independent experiments.Statistical significance was determined by Student＇s t-test(＊＊.P ＜ 0.01)

3 讨 论

通过对影响转化率的几个主要因素的研究，发现适合SPM4电穿孔转化条件为:孢子龄为6d，孢子萌发时间为4 h，电场强度为5 kV/cm。在上述条件下分别使用1 μg环状或线性化质粒pALX223 DNA进行转化，平均可以得到21个和13个转化子。当孢子龄为6 d时获得的转化子数达到峰值，可能是该时间段的孢子较新鲜且丰富，萌发能力较强适合转化。结合不同萌发时间的孢子形态及相应的转化率进行分析，当SPM4的孢子萌发时间为0 h时转化率为0可能是由于SPM4转化效率本身极低，萌发时间为0 h时的孢子具有较厚的细胞壁，电穿孔很难形成微孔通道使质粒DNA进入细胞完成转化。随着萌发时间增加，转化率随着萌发时间的增加而上升，可能是由于萌发孢子为适应菌丝生成，体积逐渐变大而细胞壁厚度相应降低，从而有利于转化。当萌发时间为5 h时转化率急剧下降可能是由于菌丝的生成和聚集。转化率先随着电场强度的加大而上升，但当电场强度大于5 kV/cm时，转化率反而下降，可能是过高的电场强度导致大量孢子死亡。在电穿孔过程中，电场强度偏低会导致细胞不宜极化产生微孔通道，造成质粒DNA不能进入细胞，无法完成转化;而电场强度过高，会导致大部分细胞产生较大的孔洞，不易复原而死亡，从而降低了细胞的存活率，也影响了转化率［12］。质粒量过多或过少均影响转化率。可能是当质粒量过少时，质粒DNA太少不足以产生高转化效率［13］;而当质粒量增大超过阈值时，细胞能吸收的质粒DNA达到饱和，继续增加质粒量也不会增加转化效率。相关原因仍需进一步研究，是否高浓度的质粒DNA影响了细胞表面的电位变化或是封闭了DNA进入的通道还有待考察［14］。本研究发现针对SPM4的萌发孢子，环状质粒较线性化质粒转化效率高，这与袁锡华的研究结论一致［9］。但本研究的前提是SPM4产孢能力较强，对于不产孢或产孢能力弱的菌株则不适用。

由于文献中可循的马尔尼菲青霉成功电转参数极少，本研究参考黑曲霉、酿酒酵母和大肠杆菌电穿孔转化相关文献［10，12-13］，通过限定部分电转参数来一一摸索各因素较优化的水平，建立了高效、简便的马尔尼菲青霉电穿孔转化体系，满足后续马尔尼菲青霉基因功能研究的需求。因此认为该方法在本实验中同样适用。本研究没有采用多因素多水平交互式表格设计是因为其实验设计复杂，所需样本量极大，误差也极大，且需要耗费大量时间和费用。

电穿孔转化方法具有快速、简单、易于操作、重复性好和转化效率高等特点，比原生质体法更适合马尔尼菲青霉的转化。马尔尼菲青霉电穿孔转化体系的建立和优化为其基因功能研究提供了良好的平台。

4 致 谢

感谢北京大学医学真菌和真菌病研究中心惠赠菌株和质粒。

［1］Vanittanakom N，Cooper CR Jr，Fisher MC，et al.Penicillium marneffei infection and recent advances in the epidemiology and molecular biology aspects［J］.Clin Microbiol Rev，2006，19(1):95-110.

［2］Andrianpoulos A.Control of morphogenesis in the human fungal pathogen Penicillium marneffei ［J］.Int J Med Microbiol，2002，292(5-6):331-347.

［3］Kummasook A，Pongpom P，Vanittanakom N.Cloning，characterization and differential expression of an hsp70 gene from the pathogenic dimorphic fungus，Penicillium marneffei［J］.DNA Seq，2007，18(5):385-394.

［4］Xi L，Xu X，Liu W，et al.Differentially expressed proteins of pathogenic Penicillium marneffei in yeast and mycelial phases［J］.J Med Microbiol，2007，56(3):298-304.

［5］Ruiz-Díez B.Strategies for the transformation of filamentous fungi［J］.J Appl Microbiol，2002，92(2):189-195.

［6］Richey MG，Marek ET，Schardl CL，et al.Transformation of filamentous fungi with plasmid DNA by electroporation ［J］.Phytopathology，1989，79(8):844-847.

［7］Firon A，Beauvais A，Latgé JP，et al.Characterization of essential genes by parasexual genetics in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus:impact of genomic rearrangements associated with electroporation of DNA ［J］.Genetics，2002，161(3):1077-1087.

［8］Weidner G，d＇Enfert C，Koch A，et al.Development of a homologous transformation system for the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus based on the pyrG gene encoding orotidine monophosphate decarboxylase［J］.Curr Genet，1998，33(5):378-385.

［9］袁锡华.马尔尼菲青霉基因转化技术的建立及HOG1基因的敲除和功能研究［D］.广西医科大学，2011.

［10］李松，王正祥.黑曲霉电转化条件的研究［J］.微生物学杂志，2010，30(1):11-15.

［11］孙九峰.乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用研究［D］.中山大学，2010.

［12］秦玉静，金建玲，鲍晓明，等.影响酿酒酵母电击转化率的条件［J］.山东大学学报，1999，34(2):236.

［13］张洋，王志强，刘斌，等.DH10B菌株高效电转化条件探究［J］.生物工程学报，2007，23(2):347.

［14］Rittich B，Spanova A.Electrotransformation of bacteria by plasmid DNAs:statistical evaluation of a model quantitatively describing the relationship between the number of electrotransformants and DNA concentration［J］.Bioelectroch Bioener，1996，40:233.