刘 超 高军丽 乐贻军 钟雄平 陈业金 王 红#

广州市第一人民医院消化科1(510180) 威海市立医院急诊科2

Prognosis

结直肠癌作为人类常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球居高不下。临床就诊的结直肠癌患者大多属于中晚期，患者的5年生存率较低。范科尼贫血(Fanconi anemia, FA)通路作为研究染色体不稳定性的特有遗传模型，是近年来肿瘤基础研究的热点。FA是一种常染色体或X-连锁隐性遗传性疾病，由调节DNA损伤的FA通路相关基因突变引起，以先天畸形、骨髓衰竭以及高度肿瘤易感性为主要表现。FA患者易患肿瘤，包括头颈部肿瘤、乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等，FA通路在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。然而，目前FA通路及其相关蛋白在结直肠癌中的作用尚未明确，相关研究数量有限。范科尼贫血互补群D2(FANCD2)作为FA通路的关键基因，是FA通路激活的标志，在FA通路中发挥关键作用。本研究通过检测FANCD2在结直肠癌中的表达，分析FANCD2与结直肠癌临床病理特征的关系，旨在为结直肠癌的诊断、治疗以及预后判断提供新途径。

对象与方法

一、研究对象

收集2012年5月～2013年9月广州市第一人民医院外科新鲜结直肠癌及其相应癌旁非癌组织手术切除标本56例，其中男30例，女26例，年龄28～76岁，平均(60.23±14.23)岁。所有病例均经术后组织病理学检查确诊。纳入2008年1月～2009年4月于广州市第一人民医院行结直肠癌手术患者93例，其中男51例，女42例，年龄25～86岁，平均(64.82±12.95)岁，收集其结直肠癌手术石蜡标本。所有患者术前均未行放、化疗。本研究方案经广州市第一人民医院医学伦理委员会批准，入选患者及其家属签属知情同意书。

二、方法

1. 主要试剂和仪器：TRIzol细胞裂解液，逆转录试剂盒，SYBR Green qPCR试剂盒(日本TAKARA公司)；兔抗人FANCD2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；两步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(丹麦Dako公司)。荧光定量PCR仪(美国 MJ Research公司)，梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

2. 标本获取：结直肠癌标本于离体后10 min内迅速取材，切取癌组织和距癌灶边缘5 cm以上相对正常的肠黏膜组织。部分标本置于-196 ℃液氮中保存待测；部分以4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋备用。

3. qPCR：取56例患者的结直肠癌及其相应癌旁非癌组织标本，以TRIzol法提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，行qPCR检测FANCD2表达。FANCD2引物上游：5’-CCG GAA TAT TGG ATT CTC ACA T-3’，下游：5’-TGA TCC GGG TRC TTA CCT G-3’；GAPDH引物上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40个循环；72 ℃ 5 min。以溶解曲线确定PCR产物的纯度，以2-ΔΔCt相对定量法行数据分析。

4. 免疫组化染色：将56例患者中的49例标本行石蜡包埋，并取93例石蜡包埋标本，行免疫组化染色，采用Envision两步法，具体步骤参照说明书进行。以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

结果判定：FANCD2 免疫组化染色阳性物质主要表达于细胞质，较少表达于细胞核。根据阳性细胞比例和阳性细胞染色强度综合判断染色结果。阳性细胞比例评分：0分，无阳性细胞数；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，>50%。阳性细胞染色强度评分：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性标记评分=阳性细胞比例评分×阳性细胞染色强度评分：0～2分，(-)；3～4分，(+)；5～6 分，(++)；7～9分，(+++)；其中≥(+)为阳性表达，(-)为阴性表达。

5. 术后随访：对93例患者进行随访，以手术结束作为随访起点，以死亡作为随访终点，未死亡的患者以2013年11月1日作为随访终点。通过门诊、电话、信件、再入院病历记录等方式随访患者生存情况。

三、统计学分析

结 果

一、FANCD2 mRNA在结直肠癌、癌旁非癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

对56例患者的标本行qPCR法检测结果显示，FANCD2 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁非癌组织[0.102(0.047, 0.163)对0.051(0.025, 0.095)](P=0.007)。采集结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移、Dukes分期、肿瘤部位等临床病理资料，分析其与结直肠癌组织FANCD2 mRNA表达的关系，以结直肠癌组织FANCD2 mRNA表达水平高于相应癌旁非癌组织定义为FANCD2 mRNA高表达，结果显示FANCD2 mRNA表达水平与淋巴结转移和Dukes分期相关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位无关(P>0.05)(见表1)。

表1 FANCD2 mRNA表达与结直肠癌临床病理特征的关系

二、FANCD2蛋白在结直肠癌、癌旁非癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

对49例患者的标本行免疫组化染色结果显示，FANCD2在结直肠癌组织中强表达，在癌旁非癌组织中弱表达(见图1)。结直肠癌组织FANCD2蛋白阳性表达率为77.6%(38/49)，癌旁非癌组织FANCD2蛋白阳性表达率为22.4%(11/49)。结直肠癌组织FANCD2蛋白表达与淋巴结转移、Dukes分期相关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位无关(P>0.05)(见表2)。

A：结直肠癌组织；B：癌旁非癌组织

临床病理特征例数FANCD2蛋白n(%)阳性表达阴性表达P值性别 男2721(77.8)6(22.2)0.45 女2217(77.3)5(22.7)年龄(岁) ≤652216(72.7)6(27.3)0.91 >652722(81.5)5(18.5)肿瘤分化程度 中高分化腺癌4636(78.3)10(21.7)1.00 低分化腺癌32(66.7)1(33.3)淋巴结转移 有2318(78.3)5(21.7)0.02 无2620(76.9)6(23.1)Dukes分期 A期～B期2216(72.7)6(27.3)0.03 C期～D期2722(81.5)5(18.5)肿瘤部位 结肠3124(77.4)7(22.6)0.41 直肠1814(77.8)4(22.2)

三、FANCD2蛋白表达与预后的关系

93例患者中结直肠癌组织FANCD2蛋白阳性表达率为66.7%(62/93)。Kaplan-Meier生存分析结果显示结直肠癌组织FANCD2蛋白阳性表达患者的术后5年生存率为35.5%，阴性表达患者为71.0%，阳性表达患者的5年生存率较阴性表达患者显著降低(P<0.01)(见图2)。

图2 不同FANCD2表达水平患者的生存曲线

结直肠癌发病率在我国逐年升高，早期诊断、判断预后并给予积极治疗是结直肠癌治疗的关键。目前已发现有15个基因突变能导致FA发生，这15个基因所编码的蛋白组成了FA信号通路[1-2]。FA通路对DNA链间交联损伤修复至关重要，DNA受到损伤后，FA通路被激活，从而对损伤DNA进行修复。若通路中任一环节出现问题，则引起DNA损伤修复障碍，继而导致肿瘤发生。

FANCD2基因位于染色体3p25.3，有44个外显子，编码长度为155、162 kDa(1 Da=0.992 1 u)的同工型蛋白质。Fu等[3]的研究发现，FANCD2可偶联pol-eta，在DNA损伤早期对其进行修复。目前关于FANCD2在肿瘤中的作用存在争议。Houghtaling等[4]对FANCD2基因敲除的小鼠研究发现，小鼠对DNA交联损伤剂敏感，易患上皮性肿瘤、小眼畸形。然而，Kao等[5]研究了FANCD2表达与黑色素瘤的关系，发现FANCD2表达水平与肿瘤细胞侵犯程度呈正相关，进一步研究发现，FANCD2表达与黑色素瘤的发生和耐药性的产生密切相关。Wysham等[6]对186例散发型卵巢癌Ⅲ、Ⅳ期患者研究显示，在早期复发患者中，41%的患者FANCD2表达升高，显著高于无复发患者，且FANCD2高表达组第一年复发率显著高于低表达组，提示FANCD2高表达与卵巢癌预后相关。本研究组前期研究[7-8]表明，FA通路参与了结直肠癌的发生、发展。Ozawa等[9]采用qPCR检测结直肠癌患者癌组织中FANCD2表达，结果显示FANCD2高表达是患者预后不良的标志。在上述研究的基础上，本研究从mRNA和蛋白水平检测FANCD2在结直肠癌组织中的表达，并对93例临床资料和回访资料完整的结直肠癌患者进行生存分析，结果显示结直肠癌患者癌组织FANCD2表达水平显著高于癌旁非癌组织，FANCD2与淋巴结转移和Dukes分期密切相关，且FANCD2蛋白阳性表达组的5年生存率较FANCD2蛋白阴性表达组明显降低，提示FANCD2可作为判断结直肠癌恶性潜能和预测预后的指标。

本研究证实FANCD2水平与结直肠癌恶性潜能相关，此为判断结直肠癌患者预后提供了参考依据。然而，本研究尚存在一定不足，如未能明确FANCD2基因的调控机制、生存分析样本量较小以及随访时间较短等，此类问题有待后续进一步研究解决。

1 Joenje H, Patel KJ. The emerging genetic and molecular basis of Fanconi anaemia[J]. Nat Rev Genet, 2001, 2 (6): 446-457.

2 Levitus M, Joenje H, de Winter JP. The Fanconi anemia pathway of genomic maintenance[J]. Cell Oncol, 2006, 28 (1-2): 23-29.

3 Fu D, Dudimah FD, Zhang J, et al. Recruitment of DNA polymerase eta by FANCD2 in the early response to DNA damage[J]. Cell Cycle, 2013, 12 (5): 803-809.

4 Houghtaling S, Timmers C, Noll M, et al. Epithelial cancer in Fanconi anemia complementation group D2 (Fancd2) knockout mice[J]. Genes Dev, 2003, 17 (16): 2021-2035.

5 Kao WH, Riker AI, Kushwaha DS, et al. Upregulation of Fanconi anemia DNA repair genes in melanoma compared with non-melanoma skin cancer[J]. J Invest Dermatol, 2011, 131 (10): 2139-2142.

6 Wysham WZ, Mhawech-Fauceglia P, Li H, et al. BRCAness profile of sporadic ovarian cancer predicts disease recurrence[J]. PLoS One, 2012, 7 (1): e30042.

7 王红. FA信号通路参与大肠癌分子发病机制的实验研究[D]. 广州: 中山大学, 2009: 1-128.

8 钟雄平，陈业金，孔红祥，等. siRNA沉默RAD18抑制结肠癌SW480细胞FANCD2蛋白泛素化并增强其对丝裂霉素C 的敏感性[J]. 实用医学杂志, 2013, 29 (11): 1731-1733.

9 Ozawa H, Iwatsuki M, Mimori K, et al. FANCD2 mRNA overexpression is a bona fide indicator of lymph node metastasis in human colorectal cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17 (9): 2341-2348.