唐云涛，粟桂蓉，谢 毓，易浪波

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000)

基于PsbA-trnH，RbcL和trnL-F序列的野生葡萄系统发育*

唐云涛1,2，粟桂蓉1,2，谢 毓1,2，易浪波1,2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000)

采用PCR技术从湘西地区的3种野生葡萄中分离PsbA-trnH、RbcL和trnL-F基因片段，克隆至pMD18-T载体中测序，结合GenBank/EMBL/DDBJ中公布的其他葡萄科植物相应cpDNA基因信息，使用Mega4构建系统发育进化树，分析其系统发育关系.结果显示，PsbA-trnH，RbcL和trnL-F这3种cpDNA基因序列均能用于葡萄科属间的分子鉴定，但结果与传统形态学分类存在一些差异，RbcL能用于葡萄属内种间的分子鉴定.

野生葡萄；PsbA-trnH；RbcL；trnL-F；系统发育

葡萄科(Vitaceae)由16个属和770多个种构成，主要分布在亚洲、非洲、澳大利亚和太平洋群岛等热带和温带地区.葡萄科在真双子叶植物中系统发育位置存在着不少争议，该科一些种属系统分类地位不明确，科间、科内甚至有些属间归属还存在混乱现象，如关于火筒树属(leea)有不少研究认为应归属于火筒树科(Leeaceae)[1-2].葡萄属(Vitis)作为该科中典型属之一，主要分布在东亚、北美以及欧洲至中亚[1].葡萄属多样性以东亚最高，北美次之，欧洲至中亚品种较少.全葡萄科中，葡萄属比较特殊，除了东亚分化的许多种外，美国中部、南部和东部也有特殊的种[3-4].中国是葡萄属植物原产国之一，已发现的葡萄种或变种多达50余个，并且还不断有新种报道.目前葡萄属系统分类也一直存在不少问题[2,4].

基于分子技术的植物分类学研究是近些年兴起的新型系统分类学方法，它可以有效解决形态学上比较复杂的分类事件.叶绿体DNA(chloroplast DNA，cpDNA)是存在于植物叶绿体中的基因组DNA，其编码的基因数量、组成和排列在不同物种间基本一致，具有进化上的保守性，因此cpDNA经常用于研究科属种以上的系统进化关系[1,5-6].湘西位于湖南省西北部，拥有丰富的亚热带植物资源，其境内有葡萄属植物17种和1个亚种，但目前有关其分子系统发育学研究未见报道.笔者拟采用PCR技术从湘西地区3种野生葡萄中分离PsbA-trnH，RbcL，trnL-F基因片段，进行克隆和测序，并结合GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已公布的葡萄科其他属种的3种相应cpDNA基因序列进行属间以及种间系统分类学研究，以期验证PsbA-trnH，RbcL，trnL-F这3种cpDNA基因序列运用于葡萄属种间亲缘关系系统分类学研究的可行性，为湘西地区葡萄属植物的系统分类研究提供分子水平证据，并为该地区葡萄属植物资源的保护与利用提供参考数据.

1 材料与方法

1.1材料

实验材料采集于湘西地区的八面山、天门山和德夯景区(见表1)，分别为毛葡萄(VitisquinquangularisRehd.)、刺葡萄(VitisdavidiiFoex.)和华南美丽葡萄(VitisbellulaRehd.).所有样品采集后于-70 ℃低温保存备用.

pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶和DNA片段纯化试剂盒及其相关分子生物学试剂购自大连TakaRa公司，其他生化试剂购自生工生物工程(上海)有限公司.

表1 3种野生葡萄采样信息及其cpDNA基因片段的序列登录号

1.2方法

1.2.1 野生葡萄中基因组DNA的提取 分别称取1 g野生葡萄幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，采用改进的CTAB法[7]提取其基因组DNA，即将研磨成粉末的样品置于含有质量分数为2%PVP和2%β-巯基乙醇的CTAB抽提液中60 ℃孵育1 h，然后用V氯仿∶V异戊醇=24∶1抽提2次，用0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，最后用体积分数70%乙醇洗涤1次，得到的DNA溶解于50 μL TE buffer(pH值为8.0)中.

1.2.2 野生葡萄cpDNA基因片段的PCR扩增 根据GenBank中公布的PsbA-trnH，RbcL和trnL-F这3种cpDNA基因序列数据，利用软件Primer 5设计3对保守引物.引物序列分别为：PsbA-trnH，上游5’-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3’，下游5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATC-3’；RbcL，上游5’-ATGTCACCAC AAACGGA-3’，下游5’-TCAAATTCAAACTTGATTTCTTTCCA-3’;trnL-F，上游5’-CGAAAT CGGTAGACGCTACG-3’，下游5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’.引物由生工生物工程(上海)有限公司合成.

PCR反应在ABI公司2720 PCR仪上进行.配制PCR反应体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(2.5 Mm)4 μL，引物(20 μM)1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，基因组DNA 50 ng，双蒸水补足至50 μL.3种cpDNA基因片段的扩增反应程序分别如下：PsbA-trnH，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；RbcL，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，42 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；TrnL-F，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

采用质量浓度10 g/L的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测.

1.2.3 PCR产物的克隆和测序 利用DNA片段纯化试剂盒分别对PCR扩增产物进行纯化，将纯化后的基因片段连入克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5a，根据氨苄抗性和蓝白斑筛选阳性克隆子，同时采用PCR对相应克隆菌株进行鉴定.提取鉴定合格的重组质粒送大连TaKaRa生物公司测序.

1.2.4 序列分析和系统进化树的构建 将获得的3种野生葡萄PsbA-trnH，RbcL和trnL-F序列送GenBank/EMBL/DDBJ数据库中进行比对，用Blast搜索程序调出相似性较高的相关序列，使用Mega4软件采用邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析和构建基于这3种cpDNA基因序列的3种野生葡萄及其系统发育关系密切物种的系统进化树，重复取样1 000次进行自展值(bootstrap value)分析以评估系统进化树的拓扑结构稳定性.

2 结果与讨论

2.1叶绿体基因片段的PCR扩增及其序列同源性比较

通过PCR扩增成功地从毛葡萄、刺葡萄和华南美丽葡萄中分离获得3种cpDNA基因序列.其中3个PsbA-trnH基因片段序列长度分别为435 bp，432 bp，429 bp，它们之间同源性达到98%；3个RbcL基因片段序列长度为1 371 bp，1 376 bp，1 374 bp，它们之间同源性达到98%；3个trnL-F序列长度为952 bp，953 bp，950 bp，它们之间同源性达到99%.将各cpDNA基因片段送GenBank注册，获得Accession number(见表1)，凭证标本均来自吉首大学植物标本室.

2.2基于cpDNA基因序列的3种野生葡萄系统发育分析

利用Blast搜索软件在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中进行相似性搜索，调出相似性较高相关植物的PsbA-trnH，RbcL和trnL-F基因序列，采用相关软件进行序列比对、进化距离矩阵计算和聚类分析，分别构建了由毛葡萄、刺葡萄、华南美丽葡萄和与其系统发育关系密切物种的系统发育进化树(见图1—3).

图1 基于PsbA-trnH基因序列的毛葡萄、刺葡萄和华南美丽葡萄及其系统发育关系密切植物的系统进化树

图1中，节点上数字为重复1 000次采样分析的自展值(>50%)；标尺为每100个核酸位点有2个核酸置换.在基于PsbA-trnH序列的进化树中，进化树总体聚为2大进化分支，葡萄属(Vitis)与爬山虎属(Parthenocissus)、乌蔹莓属(Cayratia)、崖爬藤属(Tetrastigma)、蛇葡萄属(Ampelopsis)5个属聚于同一进化分支，白粉藤属(Cissus)2个种聚于另一进化分支，说明葡萄属与爬山虎属、乌蔹莓属、崖爬藤属、蛇葡萄属等4个属具有比较近的亲缘关系，而与白粉藤属亲缘关系较远.Leeaindica独立成一进化分支，形成外群，其结果支持了火筒树属(Leea)在形态学研究中与葡萄科其他属具有较大进化差异的结论[8-9].在葡萄属的进化分支中，3种野生葡萄聚在一起，与其他2个种葡萄圆叶葡萄(V.rotundifolia)和葛雃葡萄(V.flexuos)亲缘性非常高，在进化分支上平行存在.

图2 基于RbcL基因序列的毛葡萄、刺葡萄和华南美丽葡萄及其系统发育关系密切植物的系统进化树

图2中，节点上数字为重复1 000次采样分析的自展值(>50%)；标尺为每1 000个核酸位点有2个核酸置换.基于RbcL序列的进化树总体聚为2大进化分支，葡萄属与爬山虎属、崖爬藤属聚于同一分支，蛇葡萄属与酸蔹莓属(Ampelocissus)、火筒树属聚于同一进化分支.说明葡萄属与爬山虎属、崖爬藤属具有较近的亲缘关系，而与蛇葡萄属和酸蔹莓属进化关系较远.在基于RbcL序列的进化树中，火筒树属并没有像图1一样单独聚于外群，而是与蛇葡萄属和酸蔹莓属聚于同一进化分支，但仍然与其他属进化距离较远.在葡萄属的进化分支中，3种葡萄分为2支，毛葡萄与华南美丽葡萄平行于一进化分支，而刺葡萄与酿酒葡萄(V.vinifera)聚于同一进化分支.

图3 基于trnL-F基因序列的毛葡萄、刺葡萄和华南美丽葡萄及其系统发育关系密切植物的系统进化树

图3中，节点上数字为重复1 000次采样分析的自展值(>50%)；标尺为每1 000个核酸位点有2个核酸置换.基于trnL-F序列的进化树总体聚为2大进化分支，葡萄属与俞藤属(Yua)、爬山虎属、酸蔹莓属、崖爬藤属聚于同一进化分支，而蛇葡萄属独立聚于另一进化分支.火筒树属独立于外群.在葡萄属中，3种野生葡萄同聚于葡萄属进化分支，与细本葡萄(V.thunbergii)、桑叶葡萄(V.heyneana)和酿酒葡萄(V.vinifera)平行存在.

3 结论与分析

cpDNA主要由单拷贝序列构成，在被子植物中因为其单亲遗传，与核基因相比，不受到网状进化(reticulate evolution)的影响，容易分析其进化历史.PsbA-trnH是编码光系统II蛋白D1(photosystem II protein D1，psbA)与tRNA-His基因之间的间隔序列，RbcL是核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase)的编码序列，trnL-F 区包括trnL内含子和trnL-trnF 之间的间隔区.这3种cpDNA序列已被广泛运用于植物系统发育分析.PsbA-trnH适用于科内属间的分类，RbcL适用于科间的分类，而trnL-F较适用于属内种间的分类[4,10].

笔者认为，基于3种不同cpDNA的系统发育进化树属间存在一定差异，但3株进化树都认为葡萄属与爬山虎属和崖爬藤属具有较近的亲缘关系，而与蛇葡萄属进化关系较远，这与传统形态学中认为葡萄属与蛇葡萄属应有较近进化关系，而与崖爬藤属具有较远进化关系的结论有所不同[11].PsbA-trnH，RbcL与trnL-F序列的进化树同时都认为火筒树属应该与整个葡萄科其他属植物具有较远的亲缘关系，这与一些形态学研究结果一致[8-9,11].

在基于PsbA-trnH和trnL-F的进化树中，均不能很好地显示出葡萄属种间的进化关系，可能由于其DNA片段序列较短或者同源性非常高，不能提供足够的信息来鉴别其种间差异.而基于RbcL的系统进化分析中，测得的3种野生葡萄序列与GenBank/EMBL/DDBJ中其他葡萄种相应序列能够表现出种间的进化差异，所以RbcL应该能运用于葡萄属属内种间的分子鉴定.但由于目前收录于GenBank/EMBL/DDBJ中的葡萄属RbcL基因序列较少，因此无法对其进行深入详细研究.总之，结合植物形态学特征，PsbA-trnH与trnL-F序列能用于葡萄科植物科内属间的系统发育学分析；如果对葡萄属种间进行分子鉴定，可以采用RbcL基因序列及其他分子标记.

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(责任编辑 易必武)

PhylogeneticAnalysisofThreeWildGrapesBasedonPsbA-trnH,RbcLandtrnL-FSequences

TANG Yuntao1,2,SU Guirong1,2,XIE Yu1,2,YI Langbo1,2

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China.2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

PsbA-trnH,RbcL andtrnL-F fragments were amplified from the three wild grapes in Xiangxi Autonomous Prefecture by PCR,and cloned into pMD18-T vector for sequencing.Based onPsbA-trnH,RbcL andtrnL-F gene sequences,the phylogenetic trees between these three wild grapes and other relatedVitaceaeplants were constructed by software Mega4 for analyzing their phylogenetic relationship.The results showed that all of these three cpDNA fragments could be used as molecular markers in phylogenetic analysis among genera ofVitaceae,but of which results had a little difference from that of traditional morphological methods.Furthermore,RbcL gene fragment could be used for molecular identification amongVitisspecies.

wild grape；PsbA-trnH；RbcL；trnL-F；phylogeny

1007-2985(2014)02-0085-05

2013-12-30

湖南省教育厅科学研究重点资助项目(13A078)

易浪波(1980-)，女，湖南娄底人，吉首大学生物资源与环境科学学院讲师，主要从事植物生态学研究.

Q949.4

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.019