郭小兵，代志峰，宋海容，张傅山，叶亚菲，明 亮

郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052

CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶快速检测方法的建立*

郭小兵△，代志峰，宋海容，张傅山，叶亚菲，明 亮

郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052

△男，1971年8月生，博士，副教授，研究方向：细菌耐药机制，E-mail：gxbing928@126.com

CTX-M-38；超广谱β-内酰胺酶；酶联免疫吸附实验

目的：建立一种CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的快速检测方法。方法采用梅花形双向琼脂扩散实验检测酶蛋白与抗体反应最适比；根据双抗体夹心法原理设计酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒；平行测定30次BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子表达产物，检测批内变异；分别采用所建立的ELISA法与PCR技术对146株产ESBLs大肠埃希菌进行检测，评价方法特异性；对27株非产CTX-M-38型产酶大肠埃希菌进行检测，计算假阳性率；对产CTX-M-38型ESBLs菌株不同时间段培养液进行检测，明确最适检测时间。结果抗体与4 h培养物反应最适比为164；批内检测结果变异系数为1.525%；PCR及所建立的ELISA法检测产CTX-M-38型ESBLs菌株的检出率分别为4.11%和7.53%(χ2=2.286,P=0.131)；交叉反应中存在假阳性现象(1/27)；产酶菌株培养4 h后进行ESBLs检测较为合适。结论所建立的方法适用于临床产CTX-M-38型ESBLs菌株的检测。

目前，产CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)菌株在临床上已有报道。基于其广泛耐药性，建立一种快速检测方法对于有效控制该类产酶菌株感染以及遏制耐药性扩散非常重要。产酶菌株的常用检测方法主要有表型及基因型检测两种，前者检测周期长且特异性不佳，后者往往需要特殊仪器设备，且检测成本高。免疫学技术在相关领域的应用为产ESBLs菌株的检测提供了新的思路。酶蛋白合成以后并非存在于菌体包涵体内，而是由细菌分泌至菌体外；其次，酶蛋白相对分子质量大，具有多种独特性空间构象，因此其免疫原性与免疫反应性较好；这些特点均利于免疫学检测，即采用ELISA法进行产酶菌株的检测。产ESBLs菌株主要为肠杆菌科细菌[1-2]。作者在前期研究[3]中已制备CTX-M-38型ESBLs的抗体，为该研究中建立酶联免疫吸附法(ELISA)检测产酶菌株提供了实验材料。

1 材料与方法

1.1菌株来源所有菌株均来源于郑州大学第一附属医院细菌室。BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子由作者所在研究室自行构建，用于明确酶蛋白与抗体反应最适比；产ESBLs大肠埃希菌146株，用于评价方法的特异性；产单一型别ESBLs大肠埃希菌27株(产TEM-1菌株12株、SHV-12菌株8株、CTX-M-14菌株5株、CTX-M-1 菌株2株)，用于明确检测方法交叉反应状况；产CTX-M-38型ESBLs大肠埃希菌1株，用于明确ESBLs最适检测时间；ATCC25922大肠埃希菌购于温州康泰生物科技有限公司。所有菌株经Vitek 2鉴定到种；酶型及菌株分布经PCR检测鉴定。

1.2主要试剂LB培养基、药敏纸片购于英国Oxoid公司，M-H琼脂购于郑州贝瑞特生物技术有限公司，溴化乙锭、琼脂糖、DNA Marker DL2000购于郑州宝信生物工程科技有限公司，氨苄青霉素购于上海第四制药厂，硫酸卡那霉素购于石家庄制药厂，PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.3酶蛋白与抗体反应最适比测定收集BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子4 h培养物，提取酶蛋白并调整质量浓度至5 mg/L备用。制备15 g/L琼脂糖平板，按照图1打孔。用PBS按照116、132、164、1128、1256及1512对抗体进行稀释。在琼脂板中央实验孔内滴加15 μL酶蛋白溶液，周边实验孔从1号加样孔开始，按照逆时针方向滴加相应滴度抗体，将培养皿放置于湿盒内，37 ℃孵育24～48 h，观察结果。以抗原抗体复合物沉淀线居反应孔中间时的稀释度为反应最适比[4]。

图1 双向琼脂扩散实验

1.4抗体的标记与ELISA反应板的制备采用改良过碘酸钠法及50%饱和硫酸铵沉淀法完成抗体的标记与纯化，采用常用酶标技术制备ELISA反应板。结果判断参照全国临床检验操作规程规定，以P/N比值判断，P/N≥2.1为阳性[5]。

1.5批内变异检测将BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子转种于含卡那霉素的液体LB培养基，振荡培养2 h后，加入IPTG培养过夜。提取表达产物，按照双抗体夹心ELISA法操作流程，将其分别加入ELISA反应板中，进行平行实验(30孔)。测定各孔吸光度值，并计算变异系数(CV)，明确批内变异。分别设ATCC25922大肠埃希菌及LB培养液为阴性对照及空白对照。

1.6特异性检测选取临床分离产ESBLs大肠埃希菌146株，每株平行接种于2管液体LB培养基中，振荡培养过夜后，一管提取菌株所携带质粒，进行PCR检测(上游引物5’-ATGATGACTCAGAGCA-3’，下游引物5’-AGTCAGAAACCGTGGG-3’，扩增片段大小为896 bp，采用100 μL标准反应体系)；另一管提取表达产物，进行双抗体夹心ELISA检测。2组均以ATCC25922大肠埃希菌及BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子为阴性、阳性对照。

1.7交叉反应检测收集27株临床分离产单一型别ESBLs大肠埃希菌(不携带CTX-M-38型ESBLs)，分别接种于液体LB培养基中，振荡培养过夜后，提取表达产物，按照双抗体夹心ELISA法操作流程对各个菌株产物进行检测，观察分析检测结果。同时以ATCC25922大肠埃希菌、BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子及LB培养液为阴性、阳性及空白对照。若检测结果出现阳性，则表明该法存在交叉反应现象。

1.8ESBLs最适检测时间挑取已确证产CTX-M-38型ESBLs大肠埃希菌菌株，接种于5管液体LB培养基中振荡培养。分别于培养2、4、8、18及24 h取出1管培养液，提取酶表达产物，采用双抗体夹心ELISA法进行3孔平行实验。根据检测结果，确定临床分离大肠埃希菌中ESBLs的最适检测时间。以ATCC25922大肠埃希菌为阴性对照。

1.9统计学处理采用SPSS 10.0处理数据。采用配对χ2检验比较应用PCR和双抗体夹心ELISA法检测产CTX-M-38型ESBLs菌株的检出率，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1酶蛋白与抗体反应最适比由梅花形双向琼脂扩散实验结果(图2)可知，当抗体滴度为164时，抗原抗体比例较为合适。

图2 抗原抗体最适比检测

2.2批内变异阴性对照与空白对照吸光度分别为0.05及0.01，30个实验孔吸光度为(1.51±0.02)，表明实验孔均为阳性结果。CV为1.525%，表明所建立的方法批内误差不大，可满足临床检测要求。

2.3特异性146株临床分离产ESBLs大肠埃希菌中，PCR检测产CTX-M-38型ESBLs者有6株，占4.11%；双抗体夹心ELISA法检测出11株，占7.53%，2方法相比，差异无统计学意义(χ2=2.286，P=0.131)。见表1。

表1 PCR与双抗体夹心 ELISA法检测产CTX-M-38型ESBLs菌株结果分析

2.4交叉反应27株临床分离产单一型别ESBLs(非产CTX-M-38型)菌株中，有1株检测结果为阳性，表明该法存在假阳性现象。

2.5ESBLs最适检测时间阴性对照的吸光度为0.01，2 h管达到0.46左右，4 h及以后各管吸光度均超过1.00，且改变不大，提示产酶菌株培养2 h即有酶产生，4 h及以后产酶达到高峰。见表2。

表2 ESBLs检测不同时间的吸光度

3 讨论

基于产ESBLs菌株的广谱抗药性及其广泛流行趋势，快速检测、早期诊断成为遏制其进一步扩散，提高临床抗感染治疗效果的关键[6]。ESBLs为胞外酶，宿主菌合成后释放于胞浆间隙，在培养液中可有酶的存在。据此作者设计了双抗体夹心ELISA法检测ESBLs。该研究建立的双抗体夹心ELISA法用于产ESBLs菌株的快速检测，可为临床及时提供实验室依据。

3.1抗原抗体最适比抗原抗体只有比例合适时才会产生最佳反应效果，避免形成前带或后带现象[7]。作者采用梅花形双向琼脂扩散实验判断CTX-M-38型ESBLs酶蛋白与抗体反应最适比。考虑全自动微生物快速鉴定时间为4 h，故实验中抗原浓度选择4 h培养物，抗体进行倍比稀释。结果显示，抗体效价为164时，沉淀线出现在两反应孔中间位置，表明抗体与4 h培养物反应的最适效价为164。

3.2批内变异与特异性由实验结果可知，该法CV值为1.525%，提示批内变异较小。目前，对于ESBLs的检测，PCR检测技术除准确度与特异性较高外，尚可进一步分析型间差异，故多作为其他检测方法的对照[8]。在对146株产ESBLs大肠埃希菌的检测中，PCR技术的检出率为4.11%，该法为7.53%，2种检测方法检测结果无差异，提示该法具有一定的特异性，可满足临床检测需要。

3.3交叉反应27株已确证为非产CTX-M-38型ESBLs菌株中，有1株检测结果为假阳性。CTX-M型ESBLs存在着多种亚型，根据核苷酸序列同源性可将该型ESBLs细分为5组，各亚型组间同源性仍在80%以上，组内可达90%以上；其中CTX-M-14型ESBLs流行性最广，是我国主要流行型别之一[9-11]，且与CTX-M-38核苷酸序列高度同源，酶蛋白间有多种共同抗原。该研究中所制备抗体为CTX-M-38型ESBLs多克隆抗体，一旦宿主菌同时携带CTX-M-14型ESBLs，假阳性结果在所难免。此外，ELISA检测板制备过程中关键一环在于封闭。封闭不当亦可导致假阳性结果。操作流程中，最为关键的环节是洗涤，洗涤效果不佳也会导致结果假阳性[12-13]。随着单克隆抗体的成功制备与应用，假阳性可避免或显著减少。

3.4最适检测时间ESBLs最适检测时间的确定涉及两个方面。一为宿主菌产酶过程，二要考虑整个微生物鉴定流程。从实验结果看，宿主菌在培养2 h后即有酶蛋白产生，4 h时酶量显著增多，8、18及24 h吸光度改变不大。结合检验流程，该研究确定ESBLs最适检测时间为菌株培养4 h。

综上所述，该研究采用双抗体夹心ELISA法检测CTX-M-38型ESBLs，操作简单，特异性高，可较好地满足临床检验要求。

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(2013-04-13 收稿 责任编辑 徐春燕)

Establishment of a quick detection method of CTX-M-38 type ESBLs

GUOXiaobing，DAIZhifeng，SONGHairong，ZHANGFushan，YEYafei，MINGLiang

ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

CTX-M-38；ESBLs；ELISA

Aim: To establish a quick detection method of CTX-M-38 type ESBLs. Methods: The reaction optimal ratio between CTX-M-38 type ESBLs and polyclonal antibody was confirmed by double agar diffusion test. The ELISA kit was designed according to double-antibody sandwich principle. The products of CTX-M-38 transformant were detected 30 times to obtain the information of experimental repeatability and intraassay variation;146 ESBLs-producingE.colistrains were detected by PCR and the designed method respectively to evaluate the experimental specificity; 27 isolates of ESBLs-producingE.colistrains(not carrying CTX-M-38 type ESBLs) were detected to evaluate the experimental cross-reactivity;the culture medium of CTX-M-38 type ESBLs-producingE.coliwas detected at various time to confirm the optimal detective time of ESBLs. Results: The reaction optimal ratio between CTX-M-38 type ESBLs and polyclonal antibody was 164; the results of the parallel testing indicated that the CV was 1.525%；the detection rate of PCR and ELISA was 4.11% and 7.53%(χ2=2.286,P=0.131); the designed ELISA might have the phenomenon of false-positivity(1/27); the optimal detection time for ESBLs was being cultured for 4 h. Conclusion: The established ELISA can meet the need for detecting CTX-M-38-type ESBLs-producing strains.

*河南省医学科技攻关项目 2011020014

R392

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.018