刘俊保，岳静宇，唐引引

1)南京中医药大学第一临床医学院中西医结合科 南京 210029 2)郑州大学人民医院中医科 郑州 450003 3)河南中医学院第一附属医院国家重点实验室 郑州 450000

冬凌草甲素对EC9706细胞增殖、凋亡的影响*

刘俊保1，2)△，岳静宇3)，唐引引3)

1)南京中医药大学第一临床医学院中西医结合科 南京 210029 2)郑州大学人民医院中医科 郑州 450003 3)河南中医学院第一附属医院国家重点实验室 郑州 450000

△男，1966年3月生，博士研究生，主任医师，研究方向：中西医结合肿瘤学，E-mail：Liu-371@sohu.com

冬凌草甲素；食管鳞状细胞癌；EC9706；增殖；凋亡

目的：观察冬凌草甲素对食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响。方法用MTT法检测冬凌草甲素对EC9706细胞生长的抑制作用；采用流式细胞仪技术检测冬凌草甲素对EC9706细胞周期和细胞凋亡的影响，并计算凋亡率；激光共聚焦显微镜观察不同浓度冬凌草甲素作用后EC9706细胞中游离Ca2+荧光强度的变化。结果MTT法显示冬凌草甲素作用EC9706细胞株后，抑制率随浓度增高而增高(F=370.600,P<0.001)；流式细胞仪检测结果显示，冬凌草甲素作用EC9706细胞48 h后，G1/G0期细胞均显著增多(F=24.200，P<0.001)；细胞凋亡结果显示，冬凌草甲素均能明显诱导EC9706细胞凋亡(P<0.05)，冬凌草甲素40 μmol/L组的作用效果最佳(F=10.214、37.820，P<0.001)。不同浓度冬凌草甲素均升高了EC9706细胞内游离Ca2+荧光强度(F=24.400，P<0.001)。结论冬凌草甲素可抑制EC9706细胞增殖、促进细胞凋亡。

食管癌是消化系统一种常见的恶性肿瘤，全世界每年新增食管癌病例45万人，我国发病集中在中原太行山区及南方潮汕区[1]。食管癌5 a生存率只有20%左右[2]。中医药在抑制癌肿生长、降低肿瘤临床分期、延长生存期、提高生存质量等方面具有独特的优势。冬凌草甲素是我国自行研制的一种从中药冬凌草中提取的有效成分，它是从唇形香茶属植物冬凌草中提取的一种以贝壳杉烯为骨架的四环二萜类化合物。该研究通过观察冬凌草甲素体外诱导人食管鳞状细胞癌EC9706细胞凋亡的情况，探讨其作用机制，为食管癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂冬凌草甲素购自郑州博兴生物技术公司，纯度98%。胰蛋白酶消化液、四甲基偶氮唑盐、DMEM购自北京Solarbio公司，无支原体新生牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司，细胞DNA含量检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司。无钙台氏液(NaCl 4.0 g、KCl 0.1 g、NaHCO30.5 g、Na2HPO4·12H2O 0.07 g、MgCl2·6H2O 0.105 g、葡萄糖0.5 g加400 mL超纯水搅拌溶解，调pH值为7.4，定容至500 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌)4 ℃保存备用。

1.2细胞培养及分组EC9706细胞由河南省生物工程技术研究中心提供，细胞常规培养在含体积分数10%无支原体新生牛血清的DMEM培养基中，于95%相对湿度、37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，2～3 d传代一次，隔天换液。取对数生长期的EC9706细胞，制成单细胞悬液，按50 000 mL-1的密度接种于96孔板中，每孔200 μL细胞悬液。将细胞分为空白对照组(用常规培养基培养)和不同终浓度的冬凌草甲素组(用含冬凌草甲素终浓度分别为10、20和40 μmol/L的培养基培养)。

1.3各组细胞增殖的检测将96孔板置于CO2培养箱中孵育24 h后取出，按1.2分组处理，每组设5个复孔，另设空白调零组。将培养板置于培养箱中继续孵育24 h后，弃去旧液，每孔加入180 μL RPMI 1640和20 μL MTT溶液继续孵育4 h，取出后弃上清，加入DMSO 150 μL/孔，摇床上振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处检测每孔OD值，按公式计算细胞增殖抑制率。抑制率=(空白对照组OD值-用药组OD值)/空白对照组OD值×100%[3]。实验重复3次。

1.4各组细胞周期和凋亡的测定取对数生长期的EC9706细胞，接种于25 cm2的培养瓶内，每瓶5 mL，置于CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去瓶内旧液，按1.2分组处理，分别培养48、72 h后，弃去瓶内旧液，用胰蛋白酶消化并收集细胞，用PBS洗涤2次(离心1 000 r/min，5 min/次)，收集并调整细胞密度为1×106mL-1，按照细胞周期和凋亡检测试剂盒说明书步骤操作，1 h内上流式细胞仪检测。

1.5各组细胞胞浆中游离钙离子([Ca2+]i)的激光共聚焦显微镜检测将钙荧光探针Fluo-3/AM(美国AAT公司)用DMSO配成5 mmol/L液体，促溶剂F-127(美国AAT公司)溶于DMSO，配成200 g/L的液体；分别将上述两液体加入到12.5 mL RPMI 1640液中，-20 ℃避光保存备用。细胞培养48 h后终止培养，用无钙台氏液洗涤3次，每次1 mL，取200 μL Fluo-3/AM与F-127混合液，正对微型皿的中央圆形凹槽加入，37 ℃避光孵育30 min，吸去负载液，用无钙台氏液洗涤3次，于凹槽中加入200 μL无钙台氏液，于激光共聚焦显微镜(美国Meri-dian公司)上检测[Ca2+]i。将负载好荧光探针的细胞置于载物台上，调焦距使图像达到最清晰，选取外形较规整的细胞进行观察。先用氩离子激光慢速预扫描，调至视野清晰后正式扫描。实验过程中始终保持扫描参数一致。参照文献[4]，每组选取6～8个视野，每个视野选取5个细胞。利用激光共聚焦显微镜所配备的计算与图像软件(FV10-ASW 1.6 Viewer)计算荧光强度(fluorecence intensity，FI)平均值，FI越大，[Ca2+]i越高。

1.6统计学处理采用SPSS 16.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较冬凌草甲素对EC9706细胞增殖、细胞周期及细胞胞浆中[Ca2+]i的影响，应用4×2析因设计的方差分析比较不同培养时间各组冬凌草甲素对EC9706细胞早、晚期凋亡的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1冬凌草甲素对EC9706细胞增殖的影响冬凌草甲素组在加药后24 h，倒置显微镜下观察(图1)，可见大部分细胞由梭形变为不规则形，细胞间接触松散，细胞汇合率低，出现部分漂浮细胞，部分细胞膜皱缩发泡，少量细胞固缩呈圆形或卵圆形且透亮，个别细胞变小。10、20和40 μmol/L的冬凌草甲素对EC9706细胞的增殖抑制率分别为(19.45±2.34)%、(41.38±3.32)%和(78.83±4.99)%，差异有统计学意义(F=370.600，P<0.001)。

2.2不同浓度冬凌草甲素对EC9706细胞周期和凋亡的影响见表1、2。

2.3各组细胞胞浆中[Ca2+]i的检测结果药物作用2 h后，空白对照组FI为553.83±133.67，10、20和40 μmol/L冬凌草甲素组的FI分别为2 090.241±296.24、2 354.60±511.78和2 680.22±276.59，差异有统计学意义(F=24.400，P<0.001)。用药组细胞FI明显高于对照组，说明不同浓度冬凌草甲素作用后EC9706细胞内[Ca2+]i明显上升。

图1 不同浓度冬凌草甲素对EC9706细胞增殖的影响(×200)

表1冬凌草甲素作用48h后对EC9706细胞周期的影响 %

组别nG1/G0SG2/M空白对照组351．62±0．4137．86±0．6110．76±0．76冬凌草甲素10μmol/L组361．77±4．19∗#32．73±2．21#5．51±3．04冬凌草甲素20μmol/L组361．90±2．93∗#32．21±1．34#5．89±1．99#冬凌草甲素40μmol/L组371．40±3．65∗24．16±1．49∗4．44±1．48∗F24．20023．090111．200P<0．001<0．001<0．001

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与冬凌草甲素40 μmol/L组比较，P<0.05。

表2 冬凌草甲素对EC9706细胞凋亡的影响

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与冬凌草甲素40 μmol/L组比较，P<0.05。

3 讨论

目前，食管癌病因不明，癌变的分子机制不清，治疗以手术、放疗、化疗、生物治疗为主，缺乏有效的预防措施和特异性的诊治指标与方法，因而发病率和病死率仍未得到有效控制。中医药毒副作用较小，单用中药或联合放、化疗等，在改善吞咽困难、减轻癌痛、提高免疫能力、缩小瘤体、改善全身状况、减少复发和转移、提高生存质量和5 a生存率方面疗效确切，并且可为放、化疗减毒增效。冬凌草甲素抑制细胞增殖与阻滞细胞周期有关[5]。

该实验结果显示10～40 μmol/L冬凌草甲素对于体外培养的EC9706细胞具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的能力，且其促进凋亡的能力具有浓度的依赖性，这与冬凌草甲素诱导其他肿瘤细胞的凋亡结论一致[6]。流式细胞检测仪的细胞周期结果证明不同浓度冬凌草甲素均能够使EC9706细胞阻滞于G1或G2/M期，从而使食管癌细胞生长受到抑制，其机制可能为冬凌草甲素参与调控胞膜钙通道的运输系统或启动细胞凋亡的信号传导通路等。有研究[6]表明：冬凌草甲素诱导细胞凋亡时，发现在细胞凋亡早期，线粒体出现形态改变，如线粒体增生、肿胀等。冬凌草能抑制DNA、RNA的合成，其作用靶点是DNA聚合酶[7]；其发挥抗肿瘤活性的作用机制可能是作用于凋亡可控因素，如降低bcl-2的表达水平，激活Caspase途径等诱导细胞发生凋亡[8]；端粒酶与细胞凋亡密切相关, 还可以增加对凋亡细胞的吞噬[9]，并影响细胞的信号传导[10]。

总之，冬凌草甲素作为我国自行研制的中药抗癌单体，在细胞、动物实验中均发现有抗肿瘤的作用，且在临床上试用于食管癌、胃癌等治疗显示出较好的结果，值得今后作进一步深入的研究。

[1]李晓昀,苏敏,黄海花,等.潮汕人与广府、客家人母系遗传背景差异的分析[J].西安交通大学学报:医学版,2010,31(6):664

[2]伍玥,董金成,户彦龙,等.手术切除淋巴结数和转移淋巴结数对食管鳞状细胞癌患者生存期的影响[J].郑州大学学报:医学版,2013,48(2):152

[3]姚国栋.bcl-2,bax基因与胃癌[J].中国肿瘤,2003,12(11):656

[4]Kai L,Wang ZF,Shi YL,et al.Opioid receptor antagonists increase [Ca2+]i in rat arterial smooth muscle cells in hemorrhagic shock[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(3):395

[5]郝亚宁,罗媛媛,张梅,等.冬凌草甲素协同马法兰对人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响[J].吉林大学学报:医学版,2013,39(4):699

[6]谢晓原,陈俊辉,王少彬,等.冬凌草甲素诱导人食管癌SHEE细胞凋亡及其线粒体改变[J].现代肿瘤医学,2008,16(6):907

[7]杨胜利,张巧,宋爱云,等.冬凌草甲素对大鼠肺及肝原代细胞非程序DNA合成的影响[J].河南医科大学学报,2001,36(4):415

[8]崔玉,赵斌,韩培立,等.食管鳞癌中PTEN和Caspase-3的表达及临床意义[J].西安交通大学学报:医学版,2006,27(4):356

[9]胡颖军,张进朝.冬凌草甲素现代药理研究进展[J].光明中医,2011,26(3):618

[10]李翔,叶利洪,李继承.冬凌草甲素抗肿瘤活性及其机制[J].细胞生物学杂志,2009,31(3):313

(2013-05-11 收稿 责任编辑 赵秋民)

Influence of oridonin on EC9706 cell proliferation and apoptosis

LIUJunbao1，2),YUEJingyu3),TANGYinyin3)

1)SubjectofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,theFirstClinicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029 2)DepartmentofTraditionalChineseMedicine,thePeople’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 3)StateKeyLaboratory,theFirstTeachingHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

oridonin; esophageal squamous cell carcinoma; EC9706; proliferation;apoptosis

Aim: To study the influence of oridonin on esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cell proliferation and apoptosis in vitro. Methods: MTT assay was used to detect the inhibition effect of oridonin on the growth of EC9706; flow cytometry was applied to detect the impact of oridonin on cell cycle and apoptosis of EC9706, and calculated the apoptosis rate of cells; change of Ca2+fluorescence intensity of EC9706 affected by different concentrations of oridonin was observed by laser scanning confocal microscope. Results: MTT assay showed that the inhibition rate in the experiment group increased with the rising of concentration(F=370.600,P<0.001) after oridonin acting on EC9706; results of cell cycle detected by flow cytometry showed that the number of cell in G0and G1stage increased notably after oridonin acting on EC9706 for 48 hour respectively(F=24.200，P<0.001); results of apoptosis showed that oridonin could obviously induce the apoptosis of EC9706(P<0.05), and the effect was the best when the oridonin concentration was 40 μmol/L(F=10.214，37.820，P<0.001). Different concentrations of oridonin could increase Ca2+fluorescence intensity of EC9706, and the difference was significant (F=24.400，P<0.001). Conclusion: oridonin can improve the inhibition effects on proliferation and apoptosis of EC9706 cell.

*河南省卫生厅5451项目 2011077

R735.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.003