李枫棣，鲍琳琳，朱 华，邓 巍，许黎黎，吕 琦，秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(avian influenza viruse，AIV)感染引起的禽类全身性或呼吸器官性传染病[7]。禽流感病毒(AIV)属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型，其中，甲型流感病毒依据血凝素(HA)的不同再分为1～16亚型，根据病毒神经氨酸酶(NA)的不同再分为1～9亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染,引起禽流感综合征的A型流感病毒称之为禽流感病毒[1]。禽流感病毒是引起禽类一种急性高度接触性传染病, 属于甲型流感病毒中的多种亚型。1878年意大利首次报道了禽流感。禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种。H7N9亚型禽流感病毒既往仅在禽类中发现，荷兰、日本及美国等地曾发生过禽间暴发疫情，但未发现过人的感染。2013年3月，上海、浙江以及安徽等地陆续发现人感染H7N9亚型禽流感病毒[2]。本文旨在通过全基因组序列测定及比对，对H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性进行研究，并对其毒力与致病力进行讨论。

图1 小鼠感染禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒后第4天肺组织中病毒载量

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：4周龄SPF级雌性BALB/C小鼠36只,体重9～11 g，来自中国人民解放军军事医学科学院动物中心(SCXK-(军)2007-005)。

1.1.2 毒株：禽流感H7N9病毒A/Anhui/1/2013，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所提供。

1.1.3 实验场所：中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室(注册号：CNAS BL0010)。

1.2 方法

1.2.1 将动物分成9组，每组3只，以滴鼻方式进行攻毒，50 μL/只，第一次攻毒使用毒株为禽流感H7N9病毒A/Anhui/1/2013， 106TCID50/50 μL。攻毒后第4天摘眼球取血，安乐后解剖取肺组织，生理盐水涮洗后剪成2 mm左右小块，放入含10% FBS的DMEM培养基中稍作研磨后3 000 r/min离心取上清，进行再次滴鼻攻毒，50 μL/只，直至第9代。

1.2.2 病毒载量测定：使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)试剂盒提取每一代小鼠肺组织匀浆上清的总RNA，并及时分装保存于-80℃。使用 Superscript Ⅲ (Invitrogen) 试剂盒对RNA样品进行逆转录后，取2 μL样品进行SYBR Green染料法荧光定量PCR(Real-time PCR)检测。Real-time PCR扩增反应在 StepOne PCR system (ABI)上进行，总反应体积为20 μL，其中：去离子水6 μL， 2× SYBR Green PCR Master Mix (ABI) 10 μL, 10 μM 的上，下游引物各1 μL，引物序列为：

InfA-F: 5′-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3′;

InfA-R: 5′-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3′。

Real-time PCR反应条件为：94℃ for 3 min(×1)，94℃ 30 s(×35)，58℃ 30 s(×35)， 72℃ 30 s(×35)。

1.2.4 基因组测序和比对：对所有的野生型和适应株病毒的基因片段进行高保真PCR扩增(KOD plus DNA polymerase, TOYOBO)。PCR 产物纯化和测序后使用CLUSTAL W (version 1.83)软件进行比对。

2 结果

2.1 病毒载量测定

感染野生型和鼠肺适应株病毒的小鼠在感染后第4天解剖，肺组织中均检测到病毒载量，载量一直保持在接近同一数量级。结果如图1所示：

2.3 基因比对

经过基因比对发现小鼠适应株P1的NA蛋白，P9的HA蛋白,NA蛋白以及PA蛋白共发生4处突变，分别为：HA蛋白143位的Ala突变为Thr；NA蛋白10位的Thr突变为lle，168位的Ser突变为Ile；PA蛋白4位的Phe突变为Cys其余基因未出现突变情况。具体结果如表1所示。

表1 禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒及小鼠适应株基因比对结果

3 讨论

流感病毒属RNA病毒类的正黏病毒科，是引起呼吸道感染的重要病原体[2]。流感病毒所致呼吸道感染是临床常见病、多发病，常引起地方性流行，有时可致世界性大流行。因为小鼠与人类在肺炎上病理表现的一致性[4]，基于流感病毒的小鼠模型为近年来研究病毒的致病机制、病毒跨物种传播、病毒重组预测、新型流感病毒疫情预测、治疗方案的评价、药物和疫苗的筛选评价等方面的研究的重要工具之一[5]。许多相关文献已经报道过很多影响流感病毒毒力的因素，血凝素HA是影响病毒毒力的主要因素之一[5]； NA蛋白茎部0～52个氨基酸变化与流感病毒的致病力有关。另外根据已有的大量报道，PA亚基被发现不但参与病毒复制过程，而且还参与病毒RNA转录、内切核酸酶活性、蛋白酶活性以及参与病毒粒子组装等多种病毒活动过程[6]。在此研究中，小鼠适应株P1的NA蛋白，P9的HA蛋白,NA蛋白以及PA蛋白共发生4处突变，分别为：HA蛋白143位的Ala突变为Thr；NA蛋白10位的Thr突变为lle，168位的Ser突变为Ile；PA蛋白4位的Phe突变为Cys。三个与病毒致病性和毒力相关的位点均发生了突变，但经传代后的病毒毒力与致病力是否改变仍需后续实验验证。

参考文献：

[1] 沈蕊华，李子华. 禽流感病毒[J]; 海峡预防医学杂志；2002(8)5：28-29.

[2] 杨飞飞，蒋琳，金嘉琳，等；上海市人感染H7N9禽流行性感冒死亡一例报道及相关文献综述[J]；中华传染病杂志；2013(1)4：197-200.

[3] Tang JW, et al. Emerging, novel, and known influenza virus infections in humans [J]. Infect Dis Clin North Am. 24(3): 603-617.

[4] Matsuyama, T., Sweet, C., Collie, M. H. & Smith, H.. Aspects ofvirμLence in ferrets exhibited by influenza virus recombinants of known genetic constitution [J]. Journal of Infectious Diseases 1980，141, 351-361.

[5] 鲍琳琳，孙惠惠，秦川，等A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒感染力比较[J].中国比较医学杂志;2010(20)1，26-28.

[6] Xiaojing H, Jie Z, Bartlam M, et al. 流感病毒聚合酶 PA 亚基与 PB1 多肽复合体的精细三维结构[J]. 中国基础科学, 2009, 11(2)，32-36.

[7] 忻悦, 于志君, 程凯慧, 等. H6 亚型流感病毒在小鼠肺内的适应性传代研究[J]. 中国病原生物学杂志, 2012, 7(009): 641-643.