杨玉琴，徐春华，朱召芹，田 棣, 陈丽香，杨 华, 秦波音，宋志刚，管文彩，刘 祎，蔡家麟，周晓辉，周文江,2

(1.上海市公共卫生临床中心，上海 201508； 2.复旦大学药学院， 上海 201203)

正粘病毒科禽流感血细胞凝集素神经氨酸酶流感人类禽流感H7N9亚型禽流感病毒是一种最近出现的新型H7N9禽流感病毒，其跨宿主在人类进行传播，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况[1-2]。H7N9新型流感病毒是由三个已知禽流感病毒部分重组获得[3]。截至2013年5月31日，中国内地共报告131例确诊病例，其中康复78人，在院治疗14人，死亡39人[4]。虽目前病例仍处于散发状态，但目前仍无法排除其再次爆发的可能。最近研究结果显示H7N9禽流感病毒具备“有限的人际传播能力”，因此逐渐适应中的H7N9禽流感病毒极有可能在未来发生大流行[5-6]。

本实验室前期研究中发现，从患者分离的H7N9流感病毒可以成功感染小鼠甚至导致小鼠死亡，但由于H7N9流感病毒必须在生物安全三级实验室进行，严重影响了对它的致病机制的揭示。同时，在对H7N9的了解相对较少的情况下，需要借助目前在致病机制和治疗研究较为深入的普通流感来对H7N9进行比较探讨。因此对于禽流感H7N9和普通流感发病特点的比较研究极为迫切，这将为禽流感H7N9的发病机制、药物和疫苗的研究提供线索。

1 材料和方法

1.1 病毒

选择H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(以下简称H1N1 PR8)和H7N9病毒株 A/Shanghai/4664T(H7N9)(以下简称H7N9)为研究对象，H7N9和 H1N1 PR8为本实验室保存。A/Shanghai/4664T为H7N9患者分离株。病毒经MDCK细胞和鸡胚培养滴定后，-80℃储存备用，实验均在动物生物安全三级实验室(ABSL-3)中进行[高致病性病原微生物实验室资格证书编号为卫BSL3-007;中国合格评定国家认可委员会实验室认可证书编号为NO.CNAS BL0016]，实验方案经过本单位动物伦理委员会审查。

1.2 动物

实验动物均选用SPF级雌性BALB/c小鼠，6～8周龄 (体重18～20 g)。购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2008-0016]。

1.3 感染方案

将BALB/c小鼠随机分为3组，即H1N1 PR8感染组、H7N9感染组和PBS对照组，每组10只，每笼5只，标记后分别称重。小鼠经七氟烷轻度麻醉后，滴鼻感染小鼠，每只小鼠感染病毒或PBS的量为50 μL，病毒剂量为5×103TCID50/只，置独立送风隔离笼具(IVC)中正常饲养，逐日观察小鼠发病情况，记录体重及大体变化。

1.4 动物取材

每日观察感染小鼠的活动状态及临床表现，称量体重，每组感染小鼠分别于感染后第3天和第7天脱臼处死，每组每个时间点处死3只，剩余小鼠继续观察体重及死亡情况。处死后小鼠取其肺脏，取左上肺叶于组织裂解液中用于提取组织RNA；左肺下叶于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余肺叶于冻存管置-80%冰箱中备份保存。

1.5 肺组织总RNA提取及PCR检测

使用Total RNA抽提试剂盒 (QIAGEN，美国)抽提组织中的总RNA，抽提产物用微量分光光度计(Nanodrop 1 000, 美国)测定核酸浓度(OD260/OD280)后，加 RNAase-free DNAse I 37℃ 放置20 min，然后 65℃ 放置10 min。纯化后的样本用One-step RT-PCR kit(TaKaRa，大连宝生物)进行检测，扩增体系为25 μL：12.5 μL TaqMan PCR基础液，400 nmol/L引物和300 nmol/L TaqMan探针，2.5 μL RNA模板。将96孔板子放入荧光定量PCR仪(Eppendorf Master cycler eprealplex,德国)。扩增程序: 42℃ 10 min；95℃1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45个循环。

表1 H1N1 PR8 和H7N9引物序列

1.6 肺组织病理检测

取小鼠肺组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察其病理变化。

1.7 统计学方法

小鼠的体重变化(weightinfected day-weight0 day/weight0 day×100%)，肺指数(weight of lung ×100/bodyweight)。用统计学软件GraphPad Prism Software 5.0对组间差异应用t检验分析。

2 结果

2.1 小鼠感染后症状及大体观察

正常PBS组小鼠皮毛光泽，反应灵敏，饮食饮水正常，活动正常，体重增长。H1N1 PR8感染组和H7N9感染组小鼠于感染后第2天体重开始下降，感染后第3天开始出现竖毛、聚集成堆、反应迟钝、呼吸急促、食欲减退以及活动度下降严重。H1N1 PR8感染组小鼠在感染后第5天开始死亡，对照组小鼠未见异常。在感染后7 d内PBS组小鼠体重逐渐升高，H1N1 PR8组和H7N9组逐渐减低，H1N1 PR8组较H7N9组降低更为明显，H1N1 PR8感染组在第7天降到30%以上，H7N9感染组降到20%以上(图1)；H1N1 PR8感染组和H7N9感染组小鼠在感染后第7天肺指数较第3天高，PBS对照组无显著变化。感染后3 d H1N1 PR8组小鼠肺指数与H7N9组和PBS组相比显著增高(P<0.05)，感染后7 d H1N1 PR8感染组和H7N9感染组小鼠肺指数较PBS对照组相比显著增高(P<0.05)(图2)。

2.2 感染小鼠肺组织病毒载量测定

感染后的各组小鼠，于感染第3天和第7天处死，取肺组织匀浆上清进行病毒载量分析。结果显示PBS组检测阴性，未检出病毒。H1N1 PR8感染组和H7N9感染组检测均为阳性，其病毒载量在感染后第3天均为最高，第7天均降低，H1N1 PR8感染组降低显著(P<0.05)，H7N9感染组降低不明显(P>0.05)。H1N1 PR8感染组和H7N9感染组小鼠病毒载量在感染后第3天无显著差异，第7天H7N9感染组显著高于H1N1 PR8感染组 (P<0.05)。

注： *P<0.05，**P<0.01。

2.3 感染小鼠病理组织学观察

2.3.1 肉眼观察

正常对照组小鼠肺脏呈淡粉红色，质地柔软，肺叶表面光滑润泽，无充血区。H1N1 PR8感染组和H7N9感染组均出现不同程度的肺脏病理改变，充血现象明显，呈现暗褐色外观，肺重增加。感染后3 d H1N1 PR8感染组小鼠肺脏病变面积达10%，H7N9感染组小鼠未见显著病变，感染后7 d H1N1感染 PR8感染组小鼠病变面积达95%以上，H7N9感染组小鼠病变面积只有80%左右。

2.3.2 镜下观察

正常对照组病理学检查，肺间质未见炎性细胞浸润，肺泡大小正常，无扩张及萎缩，肺泡间隔不增宽，各级支气管上皮完整无渗出物，毛细血管无充血、出血现象，仅在小支气管周围有少量淋巴细胞(彩插10图4A,D)。H1N1 PR8感染组和H7N9感染组均出现了一定程度的病理改变，在感染后3 d H1N1 PR8感染组主要改变轻度的炎症细胞浸润和水肿(彩插10图4B)；H7N9感染组主要是轻度的炎症细胞浸润(彩插10图4C)。在感染后7 d H1N1 PR8感染组主要改变是肺组织肺泡间隔增宽，肺内小血管及肺泡间隔的毛细血管扩张、淤血，肺泡腔不同程度缩小，出现大面积肺水肿(彩插10图4E)；H7N9感染组主要是大量炎症细胞浸润，包括淋巴细胞和单核细胞的浸润，肺泡腔不同程度缩小，小部分区域出现实变(彩插10图4F)。

3 讨论

BALB/c小鼠是流感病毒研究中使用最为广泛的哺乳动物模型之一[7-8]，采用H1N1 PR8感染BALB/c小鼠建立流感动物模型有很多报道[9-10]，近期有H7N9成功感染BALB/c小鼠的报道[11]。本研究主要是研究在同一感染剂量下，H1N1 PR8和H7N9病毒感染后小鼠的发病特点是否存在差异。

研究结果发现H1N1 PR8和H7N9感染后小鼠在大体病变、病毒复制水平和病理病变等方面均存在一定程度的差异。从大体观察表现来看，H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d内体重均降低，但H1N1 PR8感染小鼠更明显；H1N1 PR8感染小鼠的肺指数在感染后第3天的肺指数就已经增高，H7N9感染小鼠的肺指数在感染后第7天才增高。且H1N1 PR8感染小鼠在感染后第5天出现死亡，而H7N9感染小鼠未出现。病理结果也显示在感染后第3天时H7N9感染小鼠病变较轻，总体来看H1N1 PR8感染小鼠比H7N9感染小鼠病变重。这可能最主要的原因为H1N1 PR8为国际标准的鼠适应株，小鼠对其反应比较敏感，在同等剂量下病变明显；H7N9病毒为临床分离株，对小鼠可以致病，但鼠适应性较差。

从病毒复制水平来看， H1N1 PR8感染小鼠病毒载量在感染后第3天达最高后，第7天显著降低，而H7N9感染小鼠在感染后第3天达最高后，第7天没有显著降低。这可能是小鼠对H7N9病毒的清除能力较弱。病理结果提示H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d病变均较为严重，但H7N9感染小鼠病变主要是炎症细胞浸润，而H1N1 PR8感染小鼠除炎症细胞浸润外，还有大面积的水肿。这可能是由于不同毒株触发的小鼠免疫机制存在不同而造成的。

综上所述，本次研究通过选用H1N1 PR8和H7N9感染BALB/c小鼠，发现小鼠在两种不同毒株感染下均可发病，但发病特点有所差异，由于H7N9未经过鼠适应性，因此对小鼠的致病性不是很高，但在小鼠体内的复制力很强，可以保持一段很长的时间，而H1N1 PR8则是致病性很强，但病毒迅速降低。这两种病毒不同的致病特点将为H7N9致病机制与防治的研究提供初步线索，但是相关机制仍需进一步深入研究。本研究结果提示，由于H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1 PR8差，后续用BALB/c小鼠进行药效和疫苗评价研究时需要考虑提高病毒滴度。

参考文献：

[1] Cowling BJ, Jin L, Lau EH,etal. Comparative epidemiology of human infections with avian influenza A H7N9 and H5N1 viruses in China: a population-based study of laboratory-confirmed cases [J]. The Lancet,2013, 382(9887):129-137.

[2] Xiang N, Havers F, Chen T,etal. Use of National Pneumonia Surveillance to Describe Influenza A (H7N9) Virus Epidemiology, China, 2004-2013[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(11). doi: 10.3201/eid1911.130865.CrossRef.

[3] Gao R, Cao B, Hu Y,etal. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888-1897.

[4] http://www.chinacdc.cn/jkzt/crb/rgrgzbxqlg_5295/rgrqlgyp/201305/t20130503_80728.htm.

[5] Liu D, Shi W, Shi Y,etal. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection: phylogenetic, structural, and coalescent analyses [J]. Lancet, 2013,381(9881):1926-1932.

[6] Ai J, Huang Y, Xu K,etal.Case-control study of risk factors for human infection with influenza A(H7N9) virus in Jiangsu Province[J]. Euro Surveill,2013,18(26): 20510 CrossRef.

[7] 刘颖，邓巍，徐艳峰, 等. 甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比较[J].中国比较医学杂志,2011,21(12):1-5.

[8] 彭春香. 小鼠模型在不同亚型流感病毒致病性及跨种传播研究中的应用[J]. 中国畜牧兽医,2012,39(12):154-158.

[9] 张炬榕,王涛,申元英,等. 甲型流感病毒感染BALB/c鼠动物模型的建立[J]. 大理学院学报, 2007,6(10):25-27.

[10] 鲍琳琳, 孙惠惠, 占玲俊, 等. 甲型H1 N1流感病毒感染小鼠的发病机制[J]. 中国比较医学杂志, 2011,21(2):20-22.

[11] Zhaoqin Zhu, Yuqin Yang, Yanling Feng,etal. Infection of inbred BALB/c and C57BL/6 and outbred Institute of Cancer Research mice with the emerging H7N9 avian influenza virus [J]. Emerging Microbes & Infections, 2013,2:1-7.