赵杰，陈秀娟，刘芳，梁琳，梁磊，王萨仁，侯石磊

（内蒙古医科大学附属医院妇产科生殖中心，呼和浩特 010050）

冻融胚胎移植（FET）已成为辅助生殖技术（ART）中最重要的衍生技术之一，它不仅能够合理限制新鲜周期移植胚胎数、降低多胎率、提高单次取卵周期累计妊娠率，而且还可避免由于多次超促排卵给患者带来的医疗风险和治疗费用。影响FET临床妊娠结局的因素较多，而胚胎复苏后情况及胚胎的发育潜能是影响因素之一。本研究回顾分析了我中心冷冻胚胎融解后存活情况及过夜培养后发育情况对临床妊娠结局的影响。

材料与方法

一、研究对象

选择2012年5月至2013年10月在本中心因新鲜周期未移植及新鲜周期移植妊娠失败行FET的患者，共303 例，349个周期，女性患者平均年龄（32.7±4.9）岁、范围23～42岁，不育年限（5.15±4.08）年、范围1～16年。各组年龄、获卵数比较无显著性差异，不育原因为女方多囊卵巢综合征、输卵管阻塞、男方无精子或少精子症、行夫精人工授精3周期失败及不明原因不育等，排除子宫内膜异位症、子宫腺肌症等有明确影响子宫内膜环境的患者。内膜准备方案为自然周期183 个，人工替代周期166个。

二、方法

1.控制性超促排卵：新鲜取卵周期的控制性促排卵方案按照我中心常规方案［1］进行，根据患者情况，选择超长方案、长方案、短方案、拮抗剂方案进行促排卵，在超声引导下经阴道穿刺取卵手术，取卵后常规行体外受精（IVF）、卵胞浆内单精子注射（ICSI）及胚胎培养。

2.冷冻胚胎选择：胚胎质量评分标准根据文献［2］进行评级：选择Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级胚胎，且第2日细胞数≥2，第3日细胞数≥4；碎片≤50% 的胚胎用于冷冻。

3.胚胎冷冻及解冻：采用玻璃化冷冻试剂套装（Vitrolife，瑞典）进行冷冻，用冷冻环（Hampton Research，美国）作为载体。冷冻过程：所用试剂均要求在37℃下平衡30 min，将胚胎放入含有10mg／ml人血清白蛋白（HSA）的磷酸缓冲液（PBS）中平衡5min；移入含10mg／ml HSA、7.5%乙二醇（EG）及7.5% 二甲基亚砜（DMSO）的PBS（冷冻液1）中2 min；将胚胎移入含10 mg／ml HSA、15%EG 及15%DMSO 的PBS（冷冻液2）中，反复吹吸，将冷冻环在冷冻液2中蘸一下，形成液体膜，用吸管将胚胎放入冷冻环液体膜上，置入液氮中，将冷冻环旋到冷冻管上（胚胎在冷冻液2中的时间为20～30s）。解冻过程：于移植前一天下午解冻，解冻前将解冻试剂（Vitrolife，瑞典）平衡至37℃，将含胚胎的冷冻环小心旋下冷冻管，从液氮取出，空气中2s，置入复苏液Ⅰ（含1.0mol／L 蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中，停留30s，转移到复苏液Ⅱ（含0.5 mol／L 蔗 糖 及10 mg／ml HSA 的PBS）中停留1min，再移到复苏液Ⅲ（含0.25mol／L蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中停留2min，最后在平 衡 液（含10 mg／ml HSA 的PBS）中 平 衡5min，移至已平衡的含5mg／ml HSA 的囊胚培养液（Vitrolife，瑞典）中。

4.胚胎培养及观察：解冻后的胚胎放到平衡好的囊胚培养液中，检查透明带的完整性、卵浆的透亮程度，如有50% 以上卵裂球受损，则视为死亡。在6%CO2、5%O2、89%氮气培养箱内过夜培养。移植日观察复苏后胚胎情况，观察胚胎是否生长，将胚胎情况进行记录。

5.分组：（1）根据所移植胚胎卵裂球的损伤程度，分为3 组：移植的胚胎均无损伤的为完整组（A1，n＝193），全部移植的胚胎均有卵裂球损伤的为损伤组（A2，n＝30），移植既有无卵裂球损伤的胚胎又有卵裂球损伤的胚胎为损伤混合组（A3，n＝126）。（2）解冻后胚胎经过夜培养，根据其生长情况分为3组：所移植胚胎均有不同程度生长的胚胎为生长组（B1，n＝187），所移植胚胎均未见生长的胚胎为未生长组（B2，n＝46），所移植胚胎既有生长的胚胎又有未生长胚胎即为生长混合组（B3，n＝116）。（3）在生长组及生长混合组中，根据胚胎是否发育为桑葚胚情况，分为2组：有胚胎达到桑葚胚状态的为桑葚胚组（C1，n＝86），无胚胎达到桑葚胚状态的为无桑葚胚组（C2，n＝217）。

6.内膜及黄体准备：内膜准备方案：自然周期：月经第10 天起B 超监测，主导卵泡平均直径达14mm时，开始检测血清中黄体生成素（LH）值，出现峰值后第4 天行FET；如主导卵泡发育到16～20mm时，未测出LH 峰，则肌注人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠医药）5 000 ～10 000U，第4天后行FET。激素替代周期：月经第2 天起予口服补佳乐（BAYER，法国），行阴道B 超监测，子宫内膜厚度≥8 mm 时，肌注黄体酮（P，浙江仙琚制药）40 ～60mg／d，于肌注P的第5天行FET。

7.确定妊娠及随访：移植后14 d 行血清β-HCG 检测，提示未妊娠即停用P，若血清β-HCG检测提示妊娠，则继续黄体支持。移植后24d超声检查见孕囊、胚芽，移植后35d超声检查心管搏动者确定为临床妊娠，继续黄体支持至妊娠10～12周。

三、统计学分析

釆用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，率的比较采用卡方检验，计量资料用平均值±标准差（±s）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、基本情况

共解冻303例患者的349个周期，无取消周期；解冻胚胎834 个，存活789 个，存活率94.60%；移植胚胎789 个，种植170 个，种植率21.55%；妊娠144个周期，平均妊娠率41.26%；活产96个周期，活产率66.67%；流产（包括早、中、晚期）44个周期，流产率30.56%；异位妊娠6个周期，占4.17%。

二、胚胎损伤情况对妊娠结局的影响

解冻后移植胚胎完整组（A1）共193个周期，妊娠率45.08%，种植率24.25%，活产率70.11%，流产率27.59%；损伤组（A2）共30 个周期，妊娠率20%，种植率11.11%，活产率50%，流产率50%；损伤混合组（A3）126个周期，妊娠率40.48%；种植率19.72%，活产率62.75%，流产率33.33%（表1）。完整组（A1）在妊娠率、种植率上显著高于损伤组（A2）（P＝0.01、P＝0.002），损伤混合组（A3）在妊娠率上显著高于损伤组（A2）（P＝0.036），活产率及流产率比较，组间无显著性差异（P＞0.05）。

三、胚胎生长情况对妊娠结局的影响

过夜培养后，生长组（B1）187 个周期，妊娠率47.06%，种植率26.34%，活产率69.32%，流产率27.27%；未 生 长 组（B2）46 个 周 期，妊 娠 率34.78%；种植率为17%，活产率68.75%，流产率31.25%；生 长 混 合 组（B3）116 个 周 期，妊 娠 率34.48%，种植率为16.13%，活产率55.0%，流产率37.5%。生长组（B1）妊娠率显著高于生长混合组（B3）（P＝0.031），而种植率显著高于未生长组（B2）及生长混合组（B3）（P＝0.049、0.002）；活产率及流产率无显著性差异（表1）。

四、过夜培养后有无桑葚胚对妊娠结局的影响

过夜培养后，生长组、生长混合组共计303个周期，桑葚胚组（C1）86个周期，妊娠47个周期，妊娠率为54.65%，种植率为28.28%；无桑葚胚组（C2）共217个周期，妊娠81个周期，妊娠率为37.33%，种植率为19.76%（表1）。两组妊娠率、种植率比较均有显著差异（P＝0.006、0.015）；两组活产率及流产率无显著性差异（表1）。

讨 论

ART 临床应用中，现多在D3卵裂期胚胎进行移植，胚胎冷冻也多在此阶段进行［3］。冷冻胚胎解冻后卵裂球的存活程度反映了胚胎的内在质量，能更好地承受冷冻过程的胚胎有着更好的发育潜能［4］，冷冻和解冻过程中，一些胚胎的卵裂球细胞可能会损伤，这些损伤细胞可影响其他细胞生存及胚胎的进一步发育。虽有报道，细胞部分坏死的冷冻胚胎与细胞完整冷冻胚胎相比有相同的发育潜力，但冷冻过程本身可引起重要的细胞内改变［5］，冷冻胚胎的坏死细胞可能对存活细胞产生毒性作用，减少胚胎发育潜能等［6］。

表1 解冻后胚胎损伤情况及胚胎生长情况与临床结局［（±s），n（%）］

表1 解冻后胚胎损伤情况及胚胎生长情况与临床结局［（±s），n（%）］

注：与损伤组（A2）比较，△P＜0.05；与生长组（B1）比较，＊P＜0.05；与无桑葚胚组（C2）比较，＃P＜0.05

组 别 周期数 年龄（岁） 获卵数（个） 移植数（个） 妊娠率 种植率 活产率 流产率 异位妊娠率完整组（A1） 193 32.74±5.16 11.15±7.48 2.26±0.58 87／193（45.08）△106／437（24.25）△61／87（70.11）24／87（27.59）2／87（2.29）损伤组（A2） 30 32.92±5.72 12.33±7.16 2.1±0.66 6／30（20.00）7／63（11.11） （3／6） （3／6） 0损伤混合组（A3） 126 32.49±4.60 10.43±7.15 2.29±0.54 51／126（40.48）△4／51（7.84）组 别 周期数 年龄（岁） 获卵数（个） 移植数（个） 妊娠率 种植率 活产率 流产率 异位妊娠率57／289（19.72）32／51（62.75）17／51（33.33）生长组（B1） 187 32.05±5.34 11.21±7.52 2.19±0.55 88／187（47.06）108／410（26.34）61／88（69.32）24／88（27.27）3／88（3.41）未生长组（B2） 46 32.07±5.22 11.89±6.8 2.17±0.57 16／46（34.78）17／100（17.00）＊11／16（68.75）5／16（31.25） 0生长混合组（B3） 116 32.76±4.70 10.35±7.27 2.41±0.57＊ 40／116（34.48）＊45／279（16.13）＊22／40（55.00）15／40（37.50）3／40（7.50）组 别 周期数 年龄（岁） 卵数（个） 移植数（个） 妊娠率 种植率 活产率 流产率 异位妊娠率有桑葚胚（C1） 86 32.03±4.90 12.06±7.44 2.30±0.58 47／86（54.65）＃无桑葚胚（C2） 217 33.17±5.45 10.96±7.40 2.26±0.57 81／217（37.33）56／198（28.28）＃97／491（19.76）30／47（63.83）53／81（65.43）15／47（31.91）24／81（29.63）2／47（4.26）4／81（4.94）

本研究中，损伤组妊娠率显著低于完整组及损伤混合组，种植率显著低于完整组，提示胚胎的损伤程度是影响妊娠结局的因素。在活产率上损伤组（50.0%）及损伤混合组（62.75%）均低于完整组（70.11%），而 流 产 率 却 高 于 完 整 组（分 别 为50.0%、33.33%、27.59%），但无显著性差异，可以认为胚胎的损伤也是活产率降低及流产率升高的因素之一。然而，可能由于本研究数据量较少而未显現出有显著性差异，故有待进一步观察。

在对完整组、损伤组、损伤混合组过夜培养后观察胚胎生长情况，发现完整组、混合组及损伤组胚胎的生 长 率 逐 渐 降 低（分 别 为78.03%、62.63%、49.21%），且三组比较差异均有显著性，所以胚胎卵裂球损伤情况是影响胚胎生长的因素之一。

提前解冻胚胎，过夜培养后观察复苏后胚胎是否继续生长，对于评价胚胎种植潜能具有很大的意义［7］。Van der Elst等［8］认为，复苏后卵裂球继续发育可能对于着床时胚胎与子宫内膜的同步性更有利。此外，Laverge等［9］对复苏后无生长的胚胎进行荧光原位杂交，发现这类胚胎往往表现染色体异常，包括单倍体、三倍体、四倍体甚至六倍体和嵌合体的发生，仅有20% 左右的胚胎表现为正常的二倍体，因此提出建议不要移植这类复苏后无进一步生长的胚胎。本研究显示，胚胎解冻后过夜培养，所移植胚胎均有生长的生长组在妊娠率、种植率上高于无生长组及生长混合组，可见胚胎经过夜培养后有卵裂球细胞生长能够显著提高种植率及妊娠率，生长混合组及未生长组在妊娠率、种植率上水平相当，对于这一类患者来说，只要胚胎有未生长的，则预示此周期中所移植的胚胎发育潜能均不是很好，对妊娠及种植不利。进一步研究发现，在未生长组、生长混合组、生长组中的胚胎有损伤的病例占的比例分别是75%、53%及38%。由此可见，解冻后，细胞部分坏死的胚胎与细胞完整胚胎相比，其发育潜能较差，从而影响到妊娠率及种植率，并最终影响到活产率及流产率。

桑葚胚是有发育潜能的早卵裂期胚胎发育而来，本研究显示，复苏D3 卵裂期胚胎经过夜培养后，在生长组及混合生长组周期中，有发育到桑葚胚周期的妊娠率及种植率上均显著性高于未见到桑葚胚的周期，可见在第4天发育到桑葚胚的胚胎，其发育潜能较在第4天未见到桑葚胚的要高，这种胚胎往往预示着在第5天就能够发育为囊胚，从而是能够获得较高的妊娠率，与陈雅等［10］的报道相符合。

综上所述，复苏D3卵裂期胚胎，卵裂球细胞的坏死情况影响妊娠结局，经过夜培养，有卵裂球细胞生长的胚胎能够获得较高的种植率及妊娠率，且生长为桑葚胚的病例妊娠率及种植率均高于未获得桑葚胚的病例。可见选择质量较好的胚胎进行冷冻，可使胚胎冷冻、解冻技术而对胚胎损伤的减少，亦是提高冻融胚胎妊娠结局的关键。

［1］ 陈秀娟，王丽岩，刘芳，等.121个周期体外受精-胚胎移植临床分析［J］.内蒙古医学院学报，2010，32：433-436.

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［3］ 胡玥玥，叶云，王华，等.自然周期冷冻胚胎移植79 例分析［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2011，25：809-810.

［4］ Lightman A，Kol S，Wavner V，et al.The presence of a sponsoring embryo in a batch of poor quality thawed embryos significantly in creases pregnancy and implantation rate［J］.Fertil Steril，1997，67：711-716.

［5］ Dhall A，Anchamparuthy VM，Butler SP，et al.Gene expression and development of mouse zygotes following droplet vitrification ［J］. Theriogenology，2007，68：1292-1298.

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［9］ Laverge H，Van der Elst J，De Sutter P，et al.Fluorescent insitu hybridization on human embryos showing cleavage arrest after freezing and thawing［J］.Hum Reprod，1998，13：425-429.

［10］ 陈雅，肖仕全，林金菊，等.冻融囊胚移植后临床结局分析［J］.生殖医学杂志，2011，20：352-355.