刘 侗,康馨元,任伯颖,张红印,杜 鹤,杜 航,宋 利,张 辉,孙佳明

(长春中医药大学，长春 130117)

珍珠母Margaritiferaconcha为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii(Dunker)的贝壳[1]。珍珠母是临床上治疗失眠的常用中药,具有平肝潜阳、安神定惊、清肝明目的功效。为了进一步明确镇静安眠作用物质基础，本课题组应用超滤技术将珍珠母超微粉总蛋白粗分离为分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa多肽、>10 KDa的蛋白，利用PCPA腹腔注射造失眠模型，考察5 min内小鼠自主活动的次数，及其血中ATCH的含量变化，从而比较珍珠母不同分子量蛋白、多肽和寡肽对小鼠镇静安眠的作用，并初步研究其作用机制。

1 材料

1.1 药物和试剂 珍珠母超微粉总蛋白(本课题组自制)；对氯苯丙氨酸(PCPA)，购自Sigma公司。小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。

1.2 实验动物 昆明种小鼠，雄性60只，体质量18～20 g。长春中医药大学实验动物中心提供。

1.3 仪器设备 METTLER TOLEDO电子天平(MAX=210 g，d=0.001 g)SARTORIUS AG；CR20B2型冷冻高速离心机(日本日立)；GVDV300三频恒温超声波清洗器(江苏昆山超美)；Millipore超滤仪(美国Millipore公司)。

2 实验方法

2.1 样品制备 应用超滤技术将珍珠母超微粉总蛋白粗分离为分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa的多肽、>10 KDa的蛋白。

2.2 实验分组 将60只雄性小鼠随机分6组，每组10只,分别为空白组、模型组、阳性组、寡肽组、多肽组、蛋白组。

2.3 建立模型 PCPA小鼠失眠模型的建立，按小鼠30 mg/100 g 用量腹腔注射PCPA，空白组腹腔注射相同体积的生理盐水。腹腔注射30 h后，大鼠出现昼夜节律消失，模型成功[2]。

2.4 给药剂量 样品按生药量218.75 g/kg给药，A组、B组给同体积生理盐水，阳性组为安定剂量(按0.04 mg/20 g)，1次/d，连续给药7 d。

2.5 对小鼠自发活动的影响 给药1周后，禁食12 h，将小鼠放入自主活动仪中适应环境2 min后开始观察并记录5 min内小鼠的活动次数，并记录脑及脑干重量[3]。

2.6 样品采集与处理 末次给药12 h后，记录小鼠自主活动，取小鼠眼球血，低温2 000～3 000 r/min离心20 min，取上清，采用酶联免疫分析方法，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度。

3 结果

3.1 各组小鼠自发活动及脏器指数的比较 模型组小鼠的自主活动次数较其他组活动的次数多,阳性对照组、寡肽组自主活动次数与模型组比较有显著性统计学意义(P<0.01)，而多肽组、蛋白组与模型组比无统计学意义(P>0.05)。结果表明,寡肽组对PCPA睡眠模型小鼠有助催眠作用，而其他2组无此作用。

通过对PCPA睡眠模型小鼠脑及脑干系数比较可知，药物对小鼠脑干重量系数基本没有影响(P>0.05),但通过观察脑系数可知模型组与空白组比较有显著性统计学意义，提示PCPA药物改变了小鼠脑重量系数，同时寡肽组、阳性组与模型比较有统计学意义(P<0.05)，提示药物可能对PCPA睡眠模型小鼠脑重量系数有影响，这有可能是药物改变了PCPA睡眠模型小鼠除脑干外的其他脑组织生理指标。见表1。

表1 各组小鼠的自发活动及脏器指数的比较

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 小鼠血清中ACTH浓度比较 采用酶联免疫分析方法，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度。以测得OD值(Y)对小鼠促肾上腺皮质激素标准物的浓度(X，ng/L)做线性回归，得样品ATCH含量的标准曲线回归方程为：y=0.058 5X-0.121 5,R=0.994 5(本试剂盒性能，样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.99 0以上)。见图1。

图1 ACTH含量的标准曲线

模型组小鼠血中ACTH的含量较其他组明显降低，给药后失眠症状有明显改善，与模型组相比，ACTH的含量都升高，其中阳性对照组与模型组比较有显著统计学意义(P<0.01),寡肽组与模型组比较有统计学意义(P<0.05),因此寡肽组对PCPA睡眠模型小鼠有催眠作用，但其他2组与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清中ACTH浓度比较

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 结语

本实验采用对小鼠PCPA腹腔注射的方法来造失眠模型，PCPA是5-HT的合成抑制剂，在给予足够剂量时，它的作用可持续2周之久，除了可以降低中缝核中5-HT的浓度,还能使去甲肾上腺素、多巴胺等神经递质的浓度降低[4]。促肾上腺皮质激素(ACTH)是腺垂体分泌的微量多肽激素，是肾上腺皮质活性的主要调节者。本实验采用酶联免疫分析方法，分析血中ACTH的含量变化。结果显示，模型组与正常组相比，血中ATCH含量显著降低(P<0.01)。用药后，失眠症状有明显改善，小鼠在用药5 min内活动时间减少，并且与模型组相比血中ATCH含量显著升高,组间均有显著统计学意义(P<0.01)。实验证明对小鼠镇静安眠作用寡肽组>蛋白组>多肽组，说明珍珠母蛋白可能是通过调节ACTH来治疗失眠的。

为了进一步明确超微粉镇静安眠作用物质基础，应用超滤技术将超微粉总蛋白粗分离为分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa的多肽和>10 KDa的蛋白。并采用小鼠PCPA腹腔注射的方法来造失眠模型进行测试，结果超微粉寡肽类成分(MCP)活性最强,为镇静安眠主要活性部位，说明珍珠母寡肽类成分可能是其镇静安眠的药效物质基础之一。

[1]国家药典委员会.中国药典1部[M].北京:化学工业出版社,2010.

[2]Becko,Hemdahl P.On the accurate measurement of serotonin in whole blood[J].Scand J Clin Lab Invest,1998,58(6):505-510.

[3]戴俊,段金廒,李友宾,等.苏州产淡水珍珠生物活性评价及镇静活性物质基础研究[J].中国生化药物杂志,2008,29(5):294-298.

[4]林杏娥.交泰丸治疗失眠症的文献与实验研究[D].广州:广州中医药大学,2006.