粟君 方升佐 尚旭岚 邓波

(南京林业大学,南京,210037)

施肥对不同种源青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数的影响1)

粟君 方升佐 尚旭岚 邓波

(南京林业大学,南京,210037)

采用HPLC-MS方法研究了6种施肥处理对湖北五峰、四川沐川和湖南沅陵3个种源青钱柳(Cyclocaryapaliurus)叶中阿江榄仁酸质量分数的影响。结果表明：施肥处理对青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数有显著影响。施用EDTA叶面肥和氨基态叶面肥可以提高青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数，但根施N-P-K复合肥则降低了青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数；3个种源青钱柳的叶、根和茎中阿江榄仁酸质量分数不存在显著差异，但均是叶中最高、根中次之、茎中最低。不同施肥处理对青钱柳根和茎中阿江榄仁酸质量分数影响不显著。叶中阿江榄仁酸质量分数7、9月份较高。从单株叶中阿江榄仁酸积累量看，在9月底收获青钱柳叶较为适宜。

青钱柳；阿江榄仁酸；基因型；HPLC-MS；季节动态

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)为胡桃科青钱柳属植物，是我国特有的单种属植物，分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南等地[1]。青钱柳是珍贵的用材树种和观赏树种，其叶具有药用和保健功能[1-3]。大量研究表明，青钱柳叶中除了含有丰富的人体所必需的大量和微量元素，还含有大量具有生物活性的次生代谢产物[3-4]。三萜类化合物，特别是三萜皂甙，是天然药物中的一种重要活性成分，具有多种药理活性[5-6]。现有的研究结果表明，青钱柳特有的药用和保健功能，主要与其叶中所含有的三萜类化合物等次生代谢物质有关，其中阿江榄仁酸是重要的成分之一[1，3]。国内学者对青钱柳的人工林资源培育做了大量的研究工作，但这些研究工作主要集中在青钱柳种子休眠解除[1，7]、青钱柳组织培养[8-9]等。而关于药用青钱柳优良基因资源(种源、家系、无性系)收集和选育研究报道很少，仅对青钱柳天然群体种子性状表型多样性[10]和种源间苗期性状变异[11]进行了比较。在基因与环境的交互作用对青钱柳重要次生代谢产物积累影响上，也仅有关于黄酮类物质的报道[2]，而关于基因与环境的交互作用、青钱柳其他重要次生代谢产物积累与环境间的耦合关系以及次生代谢产物积累与生长间关系等的研究几乎处于空白状态。本研究在温室条件下，研究了不同施肥处理对3个青钱柳种源1年生苗叶中阿江榄仁酸质量分数的影响，旨在为青钱柳药用人工林栽培技术措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选自3个青钱柳种源约2个月的容器苗。5月中旬将容器苗移栽到有机塑料培养箱(50 cm×45 cm×25 cm)培养，每个培养箱使用35 kg左右泥土。试验处理时，湖北五峰、四川沐川和湖南沅陵3个青钱柳种源苗木平均高分别为(10.98±2.24)、(10.07±1.48)、(12.63±3.13)cm。试验在南京林业大学森林培育学科苗木培养室中进行。

1.2 试验设计

试验采用裂区设计，施肥为主处理，青钱柳种源为副处理。其中，肥料种类有复合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=25∶10∶16，史丹利化肥股份有限公司生产)、EDTA叶面肥(EDTA铁铵盐，淄博润叶生物科技有限公司生产)和氨基态叶面肥(氨基酸大于10%，湛江市伯伦高新科技有限公司生产)。6个施肥处理分别为：空白对照组(处理1)，施复合肥4 g·株-1(处理2)，施复合肥7 g·株-1(处理3)，施复合肥4 g·株-1+EDTA叶面肥0.02 g·株-1(处理4)，EDTA叶面肥0.02 g·株-1(处理5)，氨基态叶面肥0.02 g·株-1(处理6)。每个种源10株苗木为1个小区，试验设3个重复，共计64个小区。种植苗木株行距为6 cm×8 cm。6月初进行施肥处理，6月下旬第1次取样，以后每隔1个月取样1次。其中，6、7、8、9月份按种源不同分别取叶片制作样品，10月份按种源不同分别取根、茎、叶3个部位制作样品。把样品烘干，粉碎(20目)，密封保存待测。

1.3 阿江榄仁酸质量分数测定

参照包海燕等的方法[7]并稍作改进，具体方法和步骤如下。

样品的制作：称取0.5 g干样(精度0.000 1 g)，80%乙醇60 ℃水浴回流2 h，重复2次，回收乙醇，残渣甲醇溶解，定容到10 mL，0.45 μm有机膜过滤，作为HPLC测试液。

标准曲线的制作：配制质量浓度为203 mg·L-1的一级母液。分别吸取质量浓度为203 mg·L-1的一级母液适量，用甲醇配制1.015、2.030、10.150、20.300、50.750、101.500 mg·L-1系列质量浓度，每次进样2 μL，记录色谱峰面积，以对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得线性回归方程，Y=53.618X+17.786(R2=0.999 9)。

分析条件：①质谱条件，离子极性为负离子，电喷雾离子化，毛细管电压3 kV，锥孔电压为40 V，离子源温度120 ℃，干燥气温度400 ℃，干燥气流速450 L·h-1。检测方式为多反应离子监测(MRM)。用于定性分析监测的离子反应为，阿江榄仁酸m/z487.11→m/z408.92，碰撞电压40 eV，碰撞室压力0.4 Pa。②色谱条件，色谱柱为Hedera C18柱(150 mm×4.6 mm，5 mm)，流动相为V(甲醇)∶V(10 mmol·L-1醋酸铵水溶液)=83∶17，流速1.0 mL·min-1，柱后分流，约0.2 mL·min-1进入质谱检测器，柱温35 ℃，进样量2 μL。

通过精密度、重复性、稳定性、加样回收率等试验证明利用本方法测定青钱柳中阿江榄仁酸质量分数是可靠的。利用高效液相-质谱联用测定青钱柳阿江榄仁酸质量分数，出峰时间在2.88 min左右(图1)。

图1 阿江榄仁酸标样(A)和测定样品(B)的出峰时间和色谱峰面积

1.4 数据处理

试验数据采用Excel2003及Spss16.0软件进行分析。方差分析结果有显著差异时，采用邓肯多重比较分析处理间均值的差异显著性(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数的季节动态

施肥处理后青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数(3个种源的平均值)的季节动态见表1。尽管不同施肥处理青钱柳叶中最高阿江榄仁酸质量分数出现的月份存在一定差异，但总体看7、9月份相对较高。在施肥处理后的7、8、9、10月份中，阿江榄仁酸质量分数分别为0.292、0.246、0.317、0.233 mg·g-1(6个施肥处理的平均值)。

表1 不同施肥处理青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数的季节动态 mg·g-1

2.2 施肥和青钱柳种源对叶中阿江榄仁酸质量分数的影响

双因素方差分析结果表明，施肥处理对青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数有显著影响(p=0.01)，而不同青钱柳种源及其与施肥的交互作用对叶中阿江榄仁酸质量分数的影响不显著(表2)。由于青钱柳叶的收获时间一般在9—10月份，因此，重点比较了9、10月份不同种源和施肥处理对青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数的影响(表3和表4)。

表2 种源和施肥对青钱柳叶阿江榄仁酸质量分数影响的方差分析结果

方差来源自由度均方F值差异显著性施肥51．69×10-24．9620．010种源26．51×10-31．9110．158施肥×种源102．43×10-30．7120．710误差543．41×10-3总和72

从种源看，10月份青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数为0.183～0.273 mg·g-1(6个施肥处理的平均值)，9月份为0.302～0.327 mg·g-1(表3)，均表现为湖南沅陵种源略高，湖北五峰种源稍低的趋势，3个种源间不存在显著差异。

表3 不同青钱柳种源叶中的阿江榄仁酸质量分数

mg·g-1

注：表中数据为平均值±标准差；相同小写字母表示同一月份不同种源间差异不显著(p>0.05)。

从施肥处理看，不同施肥处理显著影响9、10月份青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数(表4)，均以处理5(EDTA叶面肥0.02 g/株)的质量分数最高，分别达到0.367、0.310 mg·g-1。以9月份为例，与对照处理相比，处理2(施复合肥4 g/株)、处理3(施复合肥7 g/株)和处理4(施复合肥4 g/株+EDTA叶面肥0.02 g/株)叶中阿江榄仁酸质量分数分别降低了26.6%、14.1%和21.9%；而处理5和处理6(氨基态叶面肥0.02 g/株)分别提高了4.8%和2.9%。

表4 不同施肥处理青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数的差异 mg·g-1

注：表中数据为平均值±标准差；不同小写字母表示同一月份不同处理存在显著差异(p<0.05)。

2.3 施肥对青钱柳根和茎中阿江榄仁酸质量分数的影响

青钱柳根和茎中阿江榄仁酸的积累量明显低于叶中(表4、表5)。方差分析结果表明，不同施肥处理对青钱柳根和茎中阿江榄仁酸含量的影响不显著(p<0.05)。10月份，青钱柳根中阿江榄仁酸质量分数为0.040～0.080 mg·g-1，茎中为0.027～0.063 mg·g-1(表5)。

表5 不同施肥处理青钱柳根和茎中阿江榄仁酸质量分数的差异(10月份采样) mg·g-1

注：表中数据为平均值±标准差；相同小写字母表示同一处理不同取样部位间差异不显著(p>0.05)。

3 结论与讨论

青钱柳作为多用途珍贵树种，其叶具有很高的保健和药用开发应用价值，已引起了人们极大的关注。养分供给状况不仅影响生物量生产，而且影响药用植物的次生代谢物质的积累。本研究结果表明，施用EDTA叶面肥(0.02 g/株)和氨基态叶面肥(0.02 g/株)可以提高青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数，但根施N-P-K复合肥降低了青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数。根施N-P-K复合肥的研究结果与前人对其它次生代谢物质含量影响的结果相似，如人工种植药用植物施用N肥使植株健壮，生物量增加时，酚类、胡萝卜素等次生代谢物质的量将会下降[12-13]；施用N肥显著降低了枸杞(Lyciumbarbarum)果实中多糖和甜菜碱的含量[14]；桉树叶片中以C为基础的次生代谢物质与N的量呈反比[15]；但与Deng等[2]对青钱柳叶中黄酮研究结果不完全一致，即在田间中等遮阴条件下，适量施用N肥有利于提高青钱柳叶中黄酮的含量。从季节动态看，叶中阿江榄仁酸质量分数以7、9月份相对较高，这可能与环境条件的变化有关；从单株叶中阿江榄仁酸积累量看，在9月底收获青钱柳叶较为合适。

同种植物不同个体的基因型常有差异，从而导致形态和成分差别，形成不同的生态型、化学型和品种。但本研究结果表明，在相同的生长环境条件下，3个青钱柳种源叶、根和茎中阿江榄仁酸质量分数不存在显著差异，与Fang等[16]对12个青钱柳种源叶中黄酮含量的研究结果不同，即青钱柳叶中的黄酮含量在不同种源间存在显著差异。这可能是由于本研究青钱柳种源数量偏少所致。从青钱柳不同器官中阿江榄仁酸质量分数的差异看，以叶中质量分数最高、根中次之、茎中最低。总体看，施肥处理对青钱柳叶中阿江榄仁酸质量分数有显著影响，对根和茎的影响不显著。

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Effects of Fertilization on Arjunolic Acid Content of DifferentCyclocaryapaliurusProvenances

/Su Jun, Fang Shengzuo, Shang Xulan, Deng Bo

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(11).-39～42

We examined the effects of six fertilization treatments on arjunolic acid content of threeCyclocaryapaliurusprovenances by HPLC-MS method. Different fertilization treatments had a significant effect on arjunolic acid content in the leaves ofC.paliurusprovenances. The addition of EDTA and ammonia leaf fertilizers improved the content of arjunolic acid in the leaves, while the application of N-P-K compound fertilizer reduced the content. There was no significant difference in arjunolic acid content in the leaf, root and stem among three provenances, but the highest content was in the leaves, followed by roots and lowest in stems. Fertilization did not significantly affect the content of arjunolic acid in roots and stems ofC.paliurusprovenance. The arjunolic acid content in the leaves shows a seasonal dynamic, the relatively high content is in July and September, respectively, and for the accumulation of single plant it is best to harvestCyclocaryapaliurusleaves in late September.

Cyclocaryapaliurus; Arjunolic acid; Fertilizer type; Genotype; HPLC-MS; Seasonal dynamic

1) 国家自然科学基金项目(31270673)；江苏高校协同创新计划资助项目；江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)。

粟君，女，1970年6月生，南京林业大学林学院，博士研究生。

方升佐，南京林业大学林学院，教授。E-mail:fangsz@njfu.edu.cn。

2014年1月27日。

S792.12

责任编辑：程 红。