王 妮, 陈新玉, 欧小利, 姜 勇, 梅柱中

(南方医科大学病理生理教研室，广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东 广州 510515)

泛素(ubiquitin)存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的含76个氨基酸残基的蛋白，游离存在于细胞内或共价缀合到各种胞浆、核和整合的膜蛋白上[1]。可通过其羧基端的甘氨酸残基与靶蛋白分子中特定的赖氨酸残基形成共价连接，被称之为蛋白质的泛素化修饰，是蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。依底物蛋白质分子中形成的多聚泛素链的不同可促进其通过26S泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)被降解(如通过K48形成的多聚泛素链)或调节其在细胞中的功能(如通过K63形成的多聚泛素链)。蛋白质的泛素化降解涉及3个步骤：第1步，泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)利用ATP激活泛素并与泛素以共价键结合；第2步，激活的泛素从E1转移到泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)；一些E2可直接把泛素传给底物，大多数情况则需要第3步，即泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)识别特定的底物，并把泛素传给底物赖氨酸[2]。其中E3连接酶处于核心的地位，它通过与底物蛋白质的直接结合而促进其发生泛素化修饰，保证了发生泛素化修饰的底物蛋白质的特异性[3]。目前在哺乳动物细胞中已经被鉴定的E3连接酶超过600种，依据其结构的不同可以大体上划分为两大类：HECT(homologous to E6AP C-terminus)家族蛋白和含有RING(really interesting new gene)结构域的E3连接酶，其中前者是单一亚基的酶类，可直接促进底物蛋白质分子的泛素化修饰，而后者多是由多个亚基组成的，以蛋白复合物的形式来行使E3连接酶的活性[4]。

在含有RING结构域的E3连接酶中，2003年被鉴定的含有BTB-Kelch结构域的蛋白家族，即KLHL(Kelch-like)蛋白家族在其氨基末端含有保守的BTB(Bric-a-brac, Tramtrack and Broad complex)结构域，在其羧基端含有5～6个Kelch结构域，它们可通过BTB结构域与Cul-3/Rbx1结合形成E3连接酶复合物，而通过其羧基端与底物蛋白质分子结合[5-7]。该家族成员在进化中高度保守，提示它们在细胞中具有重要的生理功能，但在已被鉴定的42种成员中，除了少数几种之外，绝大部分成员的功能目前尚不清楚[8]。我们在前期对美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)高通量基因表达数据库进行分析时，发现采用Toll样受体5(Toll-like receptor 5，TLR5)的特异性配体鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin fromS.typhimurium,ST-FLA)刺激CD11c+的小鼠小肠黏膜固有层(lamina propria)细胞4 h可诱导KLHL家族蛋白中的KLHL32表达水平下调[9](数据库编号GDS2212)，提示其可能与细胞的炎症反应调控有关。为了进一步的分析KLHL32蛋白在炎症反应中的功能，我们用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)诱导分化的人THP-1单核巨噬细胞克隆了该基因，并对其功能进行了初步的分析，为后续深入研究KLHL32蛋白在细胞炎症反应中的功能打下了良好的基础。

材 料 和 方 法

1 材料

真核表达载体pcDNA3.1-FLAG、THP-1细胞系和人胚胎肾293(human embryonic kidney 293, HEK293)细胞(本室保存)；DNA Ladder、KOD Plus DNA聚合酶和ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo);限制性内切酶和T4 DNA连接酶(Thermo);质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和SYBR Green Real-Time PCR试剂盒(Promega);TRIzol总RNA提取试剂和Lipofectamine LTX转染试剂盒(Life Technology);anti-FLAG M2抗体和PMA(Sigma-Aldrich);ST-FLA (Invivogen);anti-cullin-3(Cul-3)兔单克隆抗体(Epitomics);anti-mouse IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology)。引物合成及测序由Life Technology完成。

2 主要方法

2.1实时荧光定量PCR检测C57BL/6小鼠不同组织KLHL32 mRNA的表达 颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，将新鲜取出的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤等8种组织装入冻存管中，置于液氮中进行速冻，30 min后取出组织加一定量液氮充分研磨至完全粉碎。按每50 mg组织样品加TRIzol® Reagent 1 mL的量加入适量的TRIzol试剂，提取组织中总RNA并采用real-time PCR检测不同组织中KLHL32 mRNA的表达水平，以28S rRNA为内参照。小鼠KLHL32上游引物5’-CAGCAAAGAAGTGATGGCATTC-3’, 下游引物5’-GCTCCACTTTCCACCATACAAAG-3’；小鼠28S rRNA上游引物5’-GAGATTCCCACTGTCCCTACCTACT-3’，下游引物5’-GAGTCAAGCTCAACAGGGT-CTTC-3’。

2.2PMA诱导THP-1细胞的分化及采用实时荧光定量PCR检测KLHL32 mRNA的表达水平变化 THP-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 于37 ℃、5% CO2条件下在3.5 cm培养皿中培养。PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞参考已发表文献[10]，取3×105THP-1单核细胞接种于3.5 cm细胞培养皿中，加入10 μg/L PMA，混匀后置37 ℃培养48 h，吸弃培养基，采用PBS缓冲液洗2次，再加入无血清的RPMI-1640培养基于37 ℃继续培养4 h。然后吸弃无血清的RPMI-1640培养基，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，同时加入TLR5激活剂ST-FLA至终浓度为100 μg/L。置37 ℃继续培养4 h后收集细胞，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并测定其浓度和纯度。以Roche公司的反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行real-time PCR检测，人KLHL32上游引物5’-GCGACATCACCCTGATTGCT-3’，下游引物5’-CATCAGCTCCACTTTCCACCAT-3’；内参照人β-actin上游引物5’-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3’，下游引物5’-TCTCAAACATGATCTGGGTCATCT-3’。具体方法参照Invitrogen公司SYBR Green Real-Time PCR试剂盒说明书。

2.3pcDNA3.1-KLHL32-FLAG真核表达质粒的构建 以上述反转录的THP-1细胞cDNA为模板，采用PCR技术扩增人KLHL32基因的编码序列。PCR上游引物5′-GTGGTACCGCTGGAAAATGCCGTCTGAAC-3′(下划线为KpnI位点)，下游引物5′-GCTCTAGAGATGGTGCCAATCCTGTGATG-3′(下划线为XbaI位点)，扩增片段大小为1 884 bp。采用高保真DNA聚合酶KOD Plus进行PCR扩增，反应条件为94 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min,68 ℃ 2 min，共35个循环。将经KpnI和XbaI双酶切的PCR扩增产物克隆至采用同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1-FLAG中，重组质粒经限制性酶切鉴定与DNA测序证实，命名为pcDNA3.1-KLHL32-FLAG，表达的蛋白为羧基端含有FLAG标签的KLHL32融合蛋白。

2.4KLHL32蛋白BTB结构域突变体质粒的构建 通过将KLHL32蛋白的BTB结构域与Keap1和MEL-26蛋白的BTB结构域采用Clustal多序列对位排列软件进行分析，结果显示它们之间具有高度的同源性，其中Val83/Leu85/Gly87与已报道的MEL-26蛋白和人Keap1蛋白BTB结构域中参与同Cul-3蛋白相互结合的氨基酸残基高度同源[7, 11](图1)。为了分析它们对KLHL32与Cul-3结合的可能影响，以pcDNA3.1-KLHL32-FLAG质粒为模板，采用QuickChange点突变试剂盒(Stratagene)将它们同时突变为Ala。突变引物1序列5′-GTGGAGCTGATGAGGCTAATGCGCACGCTGTGACCAGCCTTG-3′，引物2序列5′-CAAGGCTGGTCACAGCGTGCGCATTAGCCTCATCAGCTCCAC-3′。 具体的操作依据其说明书进行，获得的阳性克隆经DNA序列分析验证后备用，命名为pcDNA3.1-KLHL32M-FLAG。

Figure 1. Alignment of BTB domains from human KLHL32, Keap1 and MEL-26.

2.5脂质体介导的瞬时转染和表达 HEK293细胞用含有10% FBS的DMEM，置于5% CO2培养箱中，37 ℃培养。转染前24 h内传代并将细胞接种于6 cm细胞培养皿中，待其长至约70%融合时，根据Invitrogen公司Lipofectamine® LTX and PLUSTMReagents试剂盒说明书操作，转染1 μg重组质粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG和空载体质粒pcDNA3.1-FLAG (对照)。转染后细胞置于5% CO2培养箱中，37 ℃继续培养24 h。

2.6免疫共沉淀与Western blotting检测 转染24 h后收集细胞，采用300 μL细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0, 0.2% Triton X-100, 150 mmol/L NaCl, 5% glycerol, 2 mmol/L EGTA, 1 mmol/L DTT，1×蛋白酶抑制剂)裂解细胞(冰浴1 h)，然后于12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清。取30 μL细胞裂解上清加入10 μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液，95 ℃ 5 min，为细胞全裂解液，-20 ℃保存备用。在剩余的裂解上清中各加入2 μL抗FLAG单克隆抗体，置旋转混匀仪上4 ℃孵育4 h，然后再加入20 μL protein A/G琼脂糖凝胶，4 ℃孵育过夜，再采用裂解缓冲液洗琼脂糖凝胶4次，最后一次离心后吸弃上清，于每管中加入40 μL的2×SDS-PAGE上样缓冲液，95 ℃ 5 min，为免疫共沉淀样品。分别将全细胞裂解液与免疫共沉淀样品采用12% SDS-PAGE进行分离，电泳结束后将蛋白电转移至NC膜。经5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭1 h后，再与1∶2 000稀释的Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，然后与1∶2 000稀释的HRP偶联的抗鼠IgG室温孵育1 h后，采用Pierce公司的SuperSignal West Pico化学发光底物进行显色，利用Kodak IS2000R 图像工作站进行化学发光检测。

3 统计学处理

数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，统计学分析采用t检验。

结 果

1 KLHL32蛋白的鉴定

通过对NCBI数据库的进一步分析，我们发现人KLHL32基因定位于染色体的6q16.1区，全长216 kb，编码蛋白含有620个氨基酸残基，含有1个BTB结构域与5个重复的Kelch结构域，在这2个结构域之间还存在1个BACK(BTB and C-terminal Kelch)结构域，见图2。该蛋白在进化中高度保守，如爪蟾KLHL32蛋白与人KLHL32蛋白的保守性高达95%，提示其在生物体内可能具有非常重要的功能。

Figure 2. Schematic diagram of BTB protein KLHL21.

2 KLHL32 mRNA在小鼠不同组织中的表达水平

用β-actin为内参照，采用定量PCR对KLHL32 mRNA在小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉与皮肤等8种组织中表达水平的分析结果显示，KLHL32 mRNA在脑里面的表达水平最高，其次为心与肾组织，而在皮肤里的表达水平最低，当以肺内的KLHL32表达水平为基准时(设为1)，则其在另外7种组织中的相对表达水平依次为：脑29.94±2.21、心12.88±1.53、肝0.21±0.05、脾0.09±0.04、肾12.52±1.25、肌肉0.78±0.26与皮肤0.43±0.14，见图3。为了进一步验证该结果的可靠性，我们又用28S rRNA为内参照重复上述实验，结果显示当以肺内的KLHL32表达水平为基准时(设为1)，则其在另外7种组织中的相对表达水平依次为：脑17.39±2.52、心6.88±3.49、肝0.11±0.03、脾0.15±0.08、肾5.98±2.52、肌肉0.27±0.11与皮肤0.002±0.001，与采用β-actin为内参照的实验结果相似，只是比例上存在差异(图未显示)。

3 ST-FLA激活TLR5受体诱导KLHL32 mRNA表达下调

Figure 3. Relative expression of KLHL32 mRNA in different tissues of mouse.Mean±SEM. n=3.

100 μg/L ST-FLA刺激THP-1巨噬细胞4 h可诱导KLHL32 mRNA水平显著下调(0.57±0.07，P<0.01)，而作为阳性对照的IL-8表达水平上调，为未诱导时的(7.03±1.89)倍(P<0.01)，提示KLHL32可能参与了TLR5激活下游的信号转导通路，见图4。

Figure 4. The mRNA expression of KLHL32 was down-regulated in THP-1 cells upon ST-FLA treatment.Mean±SEM. n=3. **P<0.05 vs control.

4 KLHL32蛋白对NF-κB报告基因表达的影响

KLHL32蛋白对TNF-α诱导的NF-κB转录因子活性没有明显影响，见图5。

5 KLHL32与Cul-3蛋白在HEK293细胞中存在相互结合

在HEK293细胞中，KLHL32蛋白与Cul-3蛋白之间存在特异性的结合。为了进一步分析KLHL32蛋白中的BTB结构域是否参与了与Cul-3蛋白的结合，将其保守的氨基酸残基Val83/Leu85/Gly87同时突变成丙氨酸(Ala)，免疫共沉淀实验结果显示该突变体在细胞中与Cul-3蛋白不能结合，表明KLHL32是通过其氨基端的BTB结构域与Cul-3蛋白相互结合，见图6。

Figure 5. Over-expression of KLHL32 in HEK293 cells didn’t interfere the activation of NF-κB upon TNF-α treatment.Mean±SEM.n=3.

Figure 6. KLHL32 interacted with Cul-3 protein through its BTB domain.

讨 论

KLHL32蛋白属于进化中高度保守KLHL蛋白家族，该家族成员可通过其氨基端的BTB结构域与Cul-3蛋白相互结合形成E3泛素连接酶，催化底物蛋白质的泛素化修饰，但目前对KLHL32蛋白的研究尚未见报道。本研究首先通过NCBI高通量基因表达数据库的分析，发现特异性激活CD11c+的小鼠小肠黏膜固有层细胞中的TLR5受体4 h可诱导KLHL家族蛋白中的KLHL32表达水平的下调。为了验证这一结果，我们采用TLR5特异性配体ST-FLA激活经PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞，结果显示激活TLR5受体确实可以诱导KLHL32 mRNA表达水平的下调，提示KLHL32蛋白可能参与了TLR5受体下游信号通路的调控。

TLR5受体主要表达于单核细胞，在巨噬细胞中低表达，其特异性配体是细菌的鞭毛蛋白。其被激活后可通过接头蛋白MyD88的介导，激活下游NF-κB转录因子与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，继而促进促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokine)如TNF-α、白细胞介素1与I型干扰素等的表达，构成宿主对抗细菌感染的第一道防线[12]。本结果显示KLHL32蛋白对TNF-α诱导的NF-κB转录因子活性并无明显影响，其具体机制尚有待进一步的实验来揭示。

免疫共沉淀实验结果证实了KLHL32蛋白在细胞中与Cul-3之间存在相互作用，而且它们之间的相互结合依赖于其氨基端保守的BTB结构域，提示其在细胞中可能是一种潜在的E3泛素连接酶，催化底物蛋白质分子的泛素化修饰。泛素化修饰是蛋白质一种重要的翻译后修饰形式，它在细胞中不仅可以促使靶蛋白分子通过泛素蛋白酶体途径被降解，也可以参与调控靶蛋白质分子在细胞中的定位与功能，而近年来的研究表明，蛋白质的泛素化修饰在TLR受体被激活后的下游信号转导通路中起着不可或缺的作用[13]。为了分析KLHL32蛋白在炎症信号转导通路中的可能作用，我们将其与受NF-κB转录因子调控的报告基因表达载体共转染HEK293细胞，然后再采用TNF-α进行刺激，结果显示KLHL32蛋白对TNF-α激活的NF-κB转录因子活性没有明显影响。导致这一结果的原因可能是因为TNFR1受体被TNF-α激活与TLR5受体被激活后的下游信号通路不同所致，也可能是因为报告基因检测所采用的是HEK293细胞，而非TLR5表达的单核细胞如PMA诱导分化的THP-1细胞。此外，KLHL32蛋白在细胞中也有可能并不参与对TLR5激活的NF-κB信号通路的调控，而是参与对其它下游信号转导通路如MAPK通路的调控。对KLHL32蛋白功能的深入研究有赖于鉴定其特异性的底物蛋白分子，并分析其促进底物蛋白泛素化修饰对底物蛋白功能的影响。

[参 考 文 献]

[1] 陈建明,余应年.真核泛素缀合途径研究进展[J]. 中国病理生理杂志, 2000, 16(2):175-178.

[2] 张 赟, 戴翠莲. 泛素-蛋白酶体系统在心肌梗死中的病理生理意义[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(6):1234-1236,1243.

[3] Malynn BA, Ma A. Ubiquitin makes its mark on immune regulation[J]. Immunity, 2010, 33(6):843-852.

[4] Grabbe C, Husnjak K, Dikic I. The spatial and temporal organization of ubiquitin networks[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12(5):295-307.

[5] Xu L, Wei Y, Reboul J, et al. BTB proteins are substrate-specific adaptors in an SCF-like modular ubiquitin ligase containing CUL-3[J]. Nature, 2003, 425( 6955):316-321.

[6] Furukawa M, He YJ, Borchers C, et al. Targeting of protein ubiquitination by BTB-Cullin3-Roc1 ubiquitin ligases[J]. Nat Cell Biol, 2003, 5(11 ):1001-1007.

[7] Pintard L, Willis JH, Willems A, et al. The BTB protein MEL-26 is a substrate specific adaptor of the CUL-3 ubiquitin ligase[J]. Nature, 2003, 425(6955 ):311-316.

[8] Dhanoa BS, Cogliati T, Satish AG, et al. Update on the Kelch-like (KLHL) gene family[J]. Hum Genomics, 2013, 7:13.

[9] Uematsu S, Jang MH, Chevrier N, et al. Detection of pathogenic intestinal bacteria by Toll-like receptor 5 on intestinal CD11c+lamina propria cells[J]. Nat Immunol, 2006, 7(8):868-874.

[10] Park EK, Jung HS, Yang HI, et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli[J]. Inflamm Res, 2007, 56(1):45-50.

[11] Zhang DD, Lo SC, Cross JV, et al. Keap1 is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(24):10941-10953.

[12] O’Neill LA, Golenbock D, Bowie AG. The history of Toll-like receptors: redefining innate immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(6):453-460.

[13] Chen J, Chen ZJ. Regulation of NF-κB by ubiquitination[J]. Curr Opin Immunol, 2013, 25(1):4-12.