黄 海， 赖义明， 何 旺， 董 文， 朱定军， 张一鸣， 刘 皓， 于 浩， 毕良宽， 林天歆， 黄 健， 郭正辉， 杜 涛

(中山大学孙逸仙纪念医院 1泌尿外科， 2产前诊断中心，广东 广州 510120)

前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)是一种前列腺上皮细胞Ⅱ型跨膜糖蛋白，由前列腺上皮细胞分泌，其氨基端位于细胞膜内，分子量约为100 kD，共含750个氨基酸，其中胞外段707个，跨膜段24个，胞内段19个。PSMA表达水平与前列腺癌病情的进展有明显相关性，是前列腺癌天然的靶点，在前列腺癌诊治及研究中有重大意义。近年来研究发现，PSMA具有信号转导、细胞迁移、受体效应、营养摄取等功能[1-2]。其中信号转导的机制并非完全清楚。c-Jun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinases, JNK/SAPK)信号通路是细胞内重要信号通路之一，在细胞增殖及凋亡中发挥关键作用，并与人类多种肿瘤的发生发展密切相关[3]。本研究中，我们以阻断或增强PSMA表达的前列腺癌细胞LNCaP细胞株作为研究对象，在一般培养基及JNK/SAPK信号通路抑制剂SP600125作用下，发现在LNCaP细胞PSMA的表达与p-JNK/SAPK水平及细胞增殖、细胞周期具有一定联系，推测PSMA可能通过JNK/SAPK信号通路对前列腺癌的增殖及凋亡起到调控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

利用前期研究中建立的高效阻断PSMA表达的shRNA慢病毒载体，阻断前列腺癌细胞中PSMA的表达作为实验的干扰组(shPSMA)[4]；同时利用前期构建的PSMA真核表达载体pcDNA3.1-PSMA转染前列腺癌细胞，促进前列腺癌细胞中PSMA的表达作为阳性实验组(pcDNA-PSMA)[5-6]；不做任何处理的LNCaP细胞株(购自中山大学实验动物中心)作为空白组(control)；加入JNK/SAPK抑制剂SP600125作为阴性对照研究。

RPMI-1640培养基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉玛公司)；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories)；兔抗人磷酸化JNK多克隆抗体(CST)；兔抗人PSMA单克隆抗体(Abcam)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)内参照抗体(Santa)；辣根过氧化物酶(peroxidase horseradish, HRP)标记的羊抗兔抗体(ICL)； SP600125 (CST)；BCA法蛋白定量试剂盒(上海申能博采)；柯达黑白胶片；增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒(Thermo)；超敏ECL试剂盒(Millipore)；免疫组化染色试剂盒和浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Keygen)。

2 方法

2.1细胞培养 各组细胞分别于含100 mL/L FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养；细胞每2 d换液，约5～6 d(细胞80%融合后)按1∶4传代，每天观察记录掌握细胞基本生长规律。SP600125溶于DMSO中(25 mmol/L)，分装备用。部分细胞冻存，备以下实验用。

2.2细胞内JNK/SAPK蛋白磷酸化水平检测

2.2.1Western blotting 各组细胞按每孔3×106个细胞种于6孔板中，细胞贴壁后予无血清RPMI-1640培养基换液。24 h后，一部分细胞予同样无血清培养基换液，另一部分细胞予含25 μmol/L SP600125的无血清培养基更换，全部细胞再于培养箱中孵育30 min，即用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，12% SDS-PAGE行3组细胞PSMA和磷酸化JNK蛋白分离，转于PVDF膜上，封闭后，孵PSMA(1∶1 000)Ⅰ抗、p-JNK(1∶1 500)Ⅰ抗和GAPDH (1∶10 000)过夜，次日孵HRP标记Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，暗室中加入发光液，其中PSMA使用超敏ECL发光液；p-JNK使用ECL发光液。黑白胶片曝光。

2.2.2细胞免疫化学 每组细胞按照每孔5×104个细胞接种于24孔板中培养1 d。予无血清RPMI-1640培养基换液孵育24 h，再使用一般培养基及含SP600125的培养基，外环境处理同Western blotting，多聚甲醛固定后滴入非免疫山羊血清封闭。滴入1∶1 000稀释兔抗人p-JNK单克隆抗体100 μL；将该24孔板放入自制保湿盒中，4 ℃过夜。次日洗涤后滴入生物素标记羊抗兔IgG 1 滴/孔，室温孵育20 min，洗涤。滴入辣根酶标记链酶卵白素工作液后，加入DAB液，洗脱后滴入苏木素Mayor染核。镜下观察及统计分析：镜下观察各组细胞的染色情况，每孔随机选取5个高倍视野(10×20)。确定细胞阳/阴性染色较为主观，因此选取一个较为浅染的细胞为标准细胞，浓于标准细胞为阳性细胞，浅于标准细胞为阴性细胞，并对3组细胞p-JNK的表达进行统计学分析(SPSS 17.0软件)。

2.3各组细胞增殖、细胞周期、凋亡的检测

2.3.1CCK-8法检测细胞的增殖 取各组细胞，消化分离后分别用含10%FBS的RPMI-1640培养基和加入含25 μmol/L SP600125的上述培养基重悬离心细胞后，通过细胞计数板人工计数，以2 000 cells/well接种于96孔板，每孔体积100 μL，每组设3个复孔，每2 d予相应的培养基换液1次(分别使用一般RPMI-1640培养基及含有SP600125的RPMI-1640培养基)。到检测时点时取出需检测的培养板，往培养孔中每孔加入CCK-8 试剂10 μL，后培养2 h，在酶标仪上测各组细胞的A450值，分别测24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h 7个时点，复孔检测结果取均值并绘制生长曲线。

2.3.2流式细胞仪检测细胞周期 各组细胞实验前分别使用含10% FBS的RPMI-1640培养基及含SP600125的上述培养基培养48 h。消化、重悬后移入流式管，加入2 mL 于-20 ℃预冷的70%乙醇，密封后置于4 ℃冰箱过夜。次日送入流式细胞仪室对各组细胞S期、G0-G1期、G2-M期的百分比作检测。

2.3.3流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组细胞制作细胞悬液(5×105个细胞)，具体方法同上，后加入1.25 μL Annexin V-FITC，室温(18～24 ℃)避光反应15 min后离心去上清。0.5 mL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬后加入10 μL 溴化丙啶(propidium iodide,PI)，冰上避光保存，流式细胞术检测分析。

3 统计学处理

计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，并采用单因素方差分析或者Kruskal-Wallis检验；计数资料采用Pearson2检验。统计分析软件使用SPSS 17.0。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 JNK/SAPK蛋白磷酸化水平检测结果

1.1Western blotting 如图1所示，在PSMA高表达时，p-JNK/SAPK高表达；在PSMA低表达时，p-JNK/SAPK低表达，与空白对照组相比，均存在明显的统计学差异。而在加入SP600125的培养基中，各组细胞中p-JNK/SAPK表达没有显著差异，但较常规培养组低。

1.2细胞免疫化学 图2为用免疫细胞化学的方法观察各组细胞p-JNK/SAPK的表达情况。对阳/阴性细胞的计数和统计表明，在RPMI-1640培养基中，shPSMA组的p-JNK/SAPK表达明显低于control组(P<0.05)，而pcDNA-PSMA组的p-JNK/SAPK表达明显高于control组(P<0.05)；在含有SP600125的培养基中，3组细胞p-JNK/SAPK的表达接近，无明显差异，见图2。

Figure 1. The expression of PSMA, JNK and p-JNK in different groups tested by Western blotting.Lane 1: shPSMA+SP600125; Lane 2: pcDNA-PSMA+SP600125; Lane 3: control+SP600125; Lane 4: shPSMA; Lane 5: pcDNA-PSMA; Lane 6: control group. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 细胞增殖、周期、凋亡的检测结果

2.1细胞生长曲线 在RPMI-1640培养基中，shPSMA组的增殖能力明显较control组低(P<0.05)，而pcDNA-PSMA组较control组高(P<0.05)，并在120 h后有显著差异；在含有SP600125的培养基中，3组细胞增殖能力均处于低水平，但在144 h后比在RPMI-1640培养基中的shPSMA组水平更低，见图3。

2.2流式细胞术检测细胞周期结果 在RPMI-1640培养基中，shPSMA组、pcDNA-PSMA组和control组处于S期细胞的百分比是29.58%、42.36%和36.10%；在含有SP600125的培养基中，shPSMA组、pcDNA-PSMA表达组和control组处于S期细胞的百分比是27.51%、29.21%和28.82%。在一般RPMI-1640培养基中，shPSMA组S期细胞的百分比明显低于control组，而pcDNA-PSMA组则高于control组；而在含SP600125培养基中，3组处于S期细胞的百分比均在较低水平，3组间无明显差异，见图4。

Figure 2. The expression of p-JNK/SAPK in different groups tested by immunocytochemistry (×400).Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

Figure 3. Cell growth curve of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The percentage of cells in S phase detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

2.3流式细胞术检测细胞凋亡的结果 如图5所示，常规培养条件下，shPSMA组、pcDNA-PSMA组和control组中凋亡率分别为9.6%、3.4%和4.7%；在加入SP600125时，各组的凋亡率分别为7.7%、2.1%和3.5%。在shPSMA组中，前列腺癌细胞的凋亡率明显高于control组，这与是否加入JNK抑制剂SP600125无关；而在pcDNA-PSMA表达组，细胞凋亡率明显低于control组；加入JNK抑制剂SP600125后，细胞凋亡率均低于常规培养组，但是PSMA对凋亡的调控趋势未改变。因此，PSMA可以抑制前列腺癌细胞的凋亡，JNK通路是其一条重要的通路，但是并不是唯一的通路，应该还存在其它的信号通路对细胞的凋亡进行调控。

Figure 5. Apoptotic rate of each group tested by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

讨 论

PSMA是基因位于染色体11p11～12的横跨细胞膜的Ⅱ型糖蛋白[7-8]。它是一种高特异性的前列腺癌瘤标，和肿瘤恶性程度相关。在正常的前列腺细胞中，PSMA少量表达于基底细胞[9]，在前列腺癌细胞中广泛表达，在转移性的雄激素非依赖性前列腺癌中有更高表达[10-11]。此外，PSMA在去势治疗后表达上调[12]。我们前期的研究也表明PSMA在前列腺癌的发生、发展中其重要作用，可以促进前列腺癌细胞的增殖、侵润能力，抑制凋亡发生[13]，但是关于PSMA对前列腺癌细胞调控的具体机制和细胞信号通路目前还不清楚，因此我们进行了后续的研究。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族重要成员之一，由于它可以调控细胞内的应激反应，因此也被称为应激激活蛋白激酶。JNK信号通路能介导多种胞外刺激诱导的细胞凋亡，参与了包括前列腺癌细胞在内的多种细胞的凋亡发生，在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。JNK 位于胞浆，由3 个基因编码，它们分别是：JNK1、JNK2 和JNK3。JNK1 和JNK2 基因在全身广泛表达，而JNK3 则是呈限制性表达。这3种基因都能编码产生46 kD和55 kD 的蛋白产物，因为3种基因的不同分布，执行的细胞功能也各有差异[14]。目前认为，JNK 促进细胞凋亡的机制主要有2点：(1)上调促凋亡蛋白的表达：JNK 通过使转录因子复合物AP-1 活性增强进一步促进p53、Bax、FasL、TNF 等促凋亡蛋白的表达；(2)作用于线粒体：如Bax、Bak 等促使细胞色素C释放进入胞浆，细胞色素C和caspase-9结合，最终作用于caspase-3，激活的caspase-3与凋亡底物结合引起细胞凋亡。

PSMA是位于前列腺细胞中的一种跨膜糖蛋白，而JNK是MAPK通路中最重要的信号分子，两者都与前列腺癌的进展相关。我们早期的研究提示，在前列腺癌细胞中，抑制PSMA表达后，前列腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡等均受到影响[13, 15-16]，对于其具体的机制我们进行了初步探讨，并证明PSMA可以对p38/MAPK通路进行调控，作为前列腺癌细胞中对p38通路调控的一个新的靶点[17]。同时，PSMA还可以对ERK通路进行调控，ERK通路同样参与了PSMA对前列腺癌细胞生物学影响的过程[18]。那么作为MAPK通路中另一个重要的通路JNK是否也受到PSMA的影响？为了确定PSMA和JNK磷酸化是否存在关联，以及是否对前列腺癌细胞起作用，我们设立了抑制PSMA表达的LNCaP组，增强PSMA表达组及空白组。3组分别在一般培养基和存在JNK通路抑制剂SP600125的培养基中孵育。通过检测3组细胞在2种培养条件下的JNK/SAPK通路及细胞增殖、细胞周期、凋亡等情况来验证PSMA对JNK/SAPK通路的调控及是否通过JNK/SAPK通路对前列腺癌细胞的凋亡产生调控。

与其它2组相比，抑制PSMA蛋白表达后，p-JNK/SAPK水平下降；增强PSMA表达后，p-JNK/SAPK水平升高；而在SP600125的作用下，3组JNK磷酸化水平均下降。细胞免疫组化结果也证明两者之间的关系。这个结果表明PSMA参与了p-JNK/SAPK通路的激活。此外，我们检测了3组细胞在有无JNK抑制剂情况下的增殖、细胞周期、凋亡情况。通过LNCaP细胞生长曲线表明，抑制PSMA组的生长增殖能力明显低于空白对照组，而增强PSMA表达组则高于空白对照组；但在使用SP600125培养基组中3组生长曲线相近，而且明显低于一般培养基组。通过流式细胞术评估各组细胞周期变化情况显示，在常规培养条件下，抑制PSMA表达后细胞S期百分比少于空白对照组；增强PSMA表达后则高于空白对照组；在SP600125培养基条件下，3组的S期百分比几乎相同。这个细胞周期检测的结果显示PSMA通过激活JNK通路来调控前列腺癌细胞周期。关于凋亡的检测显示在抑制PSMA表达组中，前列腺癌细胞的凋亡率明显高于增强PSMA表达组和空白对照组，这与是否加入JNK抑制剂SP600125无关；而在增强PSMA表达组，细胞凋亡率明显低于空白对照组；加入JNK抑制剂SP600125后，细胞凋亡率均低于常规培养组，但是PSMA对凋亡的调控趋势未改变。因此，结合我们前期的研究结果可以推断PSMA可以抑制前列腺癌细胞的凋亡，JNK通路是其中一条重要的通路，但是并不是唯一的通路，应该还存在其它的信号通路对细胞凋亡进行调控，比如ERK、p38、Akt等[19]。而这些通路之间的相互作用关系还不清楚，我们后期的研究将进一步进行该方面的深入研究，以阐明PSMA下游的信号通路网。

[参 考 文 献]

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