耿 红，刘剑锋，王 诺

(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)

随着重工业的飞速发展，我国不少水域被重金属污染.重金属污染不仅严重影响淡水生态系统，且易由食物链产生生物积累和放大效应.重金属经各种途径进入水体后，藻类生物是首要受害者.藻类是水生生态系统的重要成分之一，它对水生生态系统的结构和功能产生重要影响.对重金属对藻类的致毒效应，国内外已有相关研究报道，但存在争议，且有关重金属对藻类的代谢研究较少[1-3].

本文选取普通小球藻(Chlorellavulgaris)为实验藻种，研究了水体污染中常见的重金属汞和镉对该藻种生长及其相关生理生化特性如叶绿素和蛋白质含量等的影响，初步探讨了汞和镉对普通小球藻影响的生理机制，以为水体重金属污染监测和治理提供一定的理论参考.

1 材料和方法

1.1 藻种和培养条件

普通小球藻(C.vulgaris)购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，使用HB-4培养基置于(25±1)℃ 的GZX - 250 BS - III 型光照培养箱内持续充气培养备用，光照强度为100 μE/(m2·s)，光周期为12 L︰12 D.

1.2 生长曲线的测定

由分析纯HgCl2和CdCl2·2H2O配制0, 0.05,0.1,0.5,1.0,2.0 mg/L不同浓度的Hg2+和Cd2+，将0 mg/L作为对照组.实验前先配制100×母液，抽滤后置于4℃冰箱中备用，用前加入，每个浓度设立3个平行.

实验时先将培养至对数生长期的藻液接种至80 mL培养基中，起始A680约为0.05.培养24 h后，取少量藻液，在显微镜下通过血细胞计数板进行藻细胞密度计数，并在波长680 nm下测定藻吸光度A680，建立不同藻细胞密度与吸光度间的线性关系.之后每隔24 h，取各浓度少量藻液测定其吸光度A680. 用乙醇抽提叶绿素[4]，计算叶绿素(含叶绿素a 和叶绿素b)总含量：叶绿素浓度(mg/L)=(A625× 1000)/34.5.取培养到第6 d的小球藻液，采用考马斯亮蓝法测定其可溶性蛋白含量.用SPSS 18.0重复测量资料的方差分析法分析Hg2+和Cd2+对普通小球藻的生长和叶绿素含量的影响.

2 结果与分析

2.1 Hg2+、Cd2+对小球藻生长的影响

本实验在开始前对藻液进行了细胞计数和分光光度测定2种方法，以衡量吸光度值与藻细胞密度间的关系，结果显示吸光度值与藻细胞密度(cells/mL)有良好的线性关系(见图1)，线性回归方程为：y= 0.0666x+ 0.0032，R2= 0.9974，故实验中采用分光光度法测定普通小球藻数量.

藻细胞密度/(106·mL-1) 图1 藻细胞密度与吸光度间的关系 Fig.1 Relationship between algae cell density and its absorbance at 680 nm

不同浓度Hg2+、Cd2+处理下普通小球藻的生长曲线见图2.由图2a可见低浓度Hg2+(0.05～0.50 mg/L)处理组的小球藻生长比对照组好；当Hg2+浓度增大到1.00 mg/L时，小球藻生长减慢，后期甚至开始死亡，在第5天达到最大生物量，OD平均值为0.138，仅为对照组的62.44 %；当Hg2+浓度继续增大为2 mg/L时，小球藻呈现负增长，实验结束时的生物量较最初时下降了30.77%.由图2b可见，Cd2+对小球藻生长的影响也呈现类似的规律.当Cd2+浓度为0～0.50 mg/L时，小球藻生长速率随着Cd2+浓度的增加而增大；当Cd2+浓度增加到1.00 mg/L时，小球藻增长明显变缓；当Cd2+浓度达到2 mg/L时，小球藻几乎不生长直至死亡.方差分析结果显示：不同浓度的Hg2+和Cd2+对普通小球藻生长有极显著影响(p<0.01).

t/d t/d a) Hg2+；b) Cd2+ 图2 Hg2+和Cd2+对普通小球藻生长的影响Fig.2 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the growth of Chlorella vulgaris

2.2 Hg2+、Cd2+对小球藻叶绿素含量的影响

Hg2+、Cd2+对普通小球藻叶绿素含量的影响见图3.由图3a可见，低浓度Hg2+(0～0.10 mg/L)能促进小球藻叶绿素含量的增加，第6天，0.05, 0.10 mg/L Hg2+处理下的小球藻叶绿素含量比对照组分别增加了14.73%，26.74%.当Hg2+浓度增大至1 mg/L时，小球藻的叶绿素合成出现明显抑制，叶绿素含量几乎无增长；2 mg/L Hg2+处理下的小球藻叶绿素含量下降速度更快，第6天，叶绿素含量比对照组减少了94.57%，与实验开始相比下降了87.61%.图3b为Cd2+对普通小球藻叶绿素含量的影响，在0 ～ 0.5 mg/L的Cd2+浓度范围内，小球藻的叶绿素含量随着Cd2+浓度的增加而增加；当Cd2+浓度增加到1mg/L时，叶绿素的含量明显低于对照组，其增长曲线呈现钟罩型，在实验第3天达到叶绿素含量的最大值(1.246 mg/L)；2 mg/L Cd2+处理下的小球藻叶绿素含量呈负增长，第6天较对照组下降了87.14%.方差分析结果显示不同浓度的Hg2+和Cd2+对小球藻叶绿素含量有极显著影响(p<0.01).

t/d t/da) Hg2+；b) Cd2+图3 Hg2+和Cd2+对普通小球藻叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the chlorophyll content of Chlorella vulgaris

2.3 Hg2+、Cd2+对小球藻蛋白质含量的影响

Hg2+、Cd2+对小球藻蛋白质含量的影响见图4. 由图4可见，普通小球藻蛋白质含量随着Hg2+、Cd2+浓度的增加先增加后减少，0.1 mg/L Hg2+处理下的小球藻蛋白质含量值最大，为26.89 μg/mL；而Cd2+处理下的小球藻蛋白质含量则是在Cd2+浓度为0.5 mg/L时达到最大值，为15.84 μg/mL.当Hg2+、Cd2+浓度增加到1 mg/L时，小球藻蛋白质合成明显抑制；当浓度进一步增大到2 mg/L时，则藻液中无蛋白质积累.方差分析结果显示不同浓度的Hg2+和Cd2对普通小球藻蛋白质含量有显著影响(p<0.01).

ρ/(mg·L-1)图4 Hg2+和Cd2+对普通小球藻蛋白质含量的影响Fig.4 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the content of protein of Chlorella vulgaris

3 讨论

细胞计数法是计数藻细胞数量的最基本方法，也是判断其他测定方法有效性的依据，其操作简单，但工作量大，重现性不好，易破坏样品，人为因素影响大，误差大；分光光度法灵敏度高，操作简便快速，不易破坏样品，人为误差较小.本研究通过对2种方法的比较发现通过分光光度法测定的吸光度值与细胞计数法得到的藻细胞密度间有较好的相关性，故采用分光光度法来描述普通小球藻(C.vulgaris)生长状态的变化.此外，研究表明，细胞生长的前期主要利用培养液中的营养物质进行分裂繁殖，增加生物量，当营养物质消耗将尽，生物量积累到一定程度后，细胞进入生长的平衡期，此时开始积累大分子代谢产物，胞内蛋白主要在此期间进行[5].故本实验中选取进入平衡期的藻液用于分析细胞里的蛋白质含量.

本实验结果表明，低浓度(0 ～ 0.50 mg/L)Hg2+和Cd2+能促进普通小球藻的生长、叶绿素和蛋白质合成，是由于Hg2+和Cd2+对普通小球藻的“毒性兴奋效应”[2].Calabrese归纳了1998年以前的8500多个研究，发现共有350个研究，计593次实验报告了低剂量刺激效应[6].当Hg2+和Cd2+浓度增加到1 mg/L时，藻细胞生长明显抑制，叶绿素含量减少，蛋白质合成量陡降；当重金属浓度增大至2 mg/L时，蛋白质含量几乎为零，小球藻开始大量死亡.这是因为高浓度的Hg2+和Cd2+超出了细胞所需和细胞正常调节所耐受的浓度范围，使光合作用系统受到不可修复的破坏，令叶绿素酶活性失调，叶绿素分解加快，抑制了叶绿素的合成[2].赵瑾等[3]研究表明重金属可通过破坏藻细胞的捕光天线系统，阻断藻胆蛋白对光电子的捕获和传递，从而抑制光合作用，最终抑制蓝藻的生长和繁殖，导致藻类生物量的不断降低.大量的Cd2+进入藻细胞后干扰了离子间原有的平衡系统，造成离子的吸收、运输、渗透和调节等方面的障碍，使叶绿素含量下降、蛋白质合成受到抑制[2].

本实验中，当Hg2+和Cd2+浓度均增至2 mg/L时，小球藻第6天的生物量较对照组分别下降了81.85 %和91.67 %，叶绿素含量则分别下降了94.57%和87.19 %，由此可见，Hg2+和Cd2+对普通小球藻的毒性差异随所测定指标的不同而有所不同.吴振斌等[7]研究结果显示Hg2+对伊乐藻(Elodea nuttallii)的毒性约为Cd2+的4倍，但不同植物对金属离子的毒性反应顺序可能有变化，刘益浩[8]研究也表明藻在重金属离子下的暴露时间对毒性的高低也有影响.

参 考 文 献

[1] 阎 海,潘 纲,霍润兰. 铜、锌和锰抑制月形藻生长的毒性效应[J]. 环境科学学报,2001，21(3): 328-332.

[2] 阎春兰,丁华堆. 镉对集胞藻PCC6803生长的影响[J].中南民族大学学报：自然科学版，2008, 27(4): 34-36.

[3] 赵 瑾,常学秀,吴 程,等. Ni2+胁迫对铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)和集胞藻(Synechocystissp.)的生长和光合色素的影响 [J].生态毒理学报,2010, 5(5): 679-684.

[4] 岳霞丽,张新萍,胡先文,等.苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长效应研究[J].中国农业科学,2006,39(9): 1823-1827.

[5] 杨海波,于 媛,刘 艳,等. 营养元素对小球藻生长及胞内蛋白质和多糖含量的影响[J].水产科学,2004, 23(1): 6-9.

[6] Calabrese E J. Hormesis: principles and applications for pharmacology and toxicology [J].Am J Pharmacol Toxicol, 2008, 3(1): 59-71.

[7] 吴振斌,马剑敏,赵 强,等. Hg2+、Cd2+及其复合胁迫对伊乐藻的毒害[J].中国环境科学,2005,25(3): 262-266.

[8] 刘益浩. 斜生栅藻与重金属的相互作用研究[D] .南京：河海大学, 2007.