韦苇，顾绍庆，李文静，马晓蒙，赵媛

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.江苏大学附属人民医院儿科，江苏镇江212002）

人巨细胞病毒体外感染对外周血单个核细胞的趋化功能

韦苇1，顾绍庆2，李文静1，马晓蒙1，赵媛1

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.江苏大学附属人民医院儿科，江苏镇江212002）

目的：探讨人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）体外感染对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的趋化功能，及地塞米松对病毒趋化作用的影响。方法：将HCMV AD169株稀释成梯度半数组织培养感染量（tissue culture infective dose，TCID50），即5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50，分别感染人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF），培养24，48，72，96 h后提取上清液，趋化PBMC，于倒置显微镜高倍镜下观察并计数被趋化的PBMC，比较趋化作用的强弱；同时用不同质量浓度的地塞米松（0.125，1.25，12.5，25，50，100μg／m L）感染HELF，观察其对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用的影响，0μg／mL作为对照。结果：5 TCID50与10 TCID50之间，80 TCID50与1 00 TCID50之间，1 00 TCID50与1 000 TCID50之间，培养24，48，72，96 h时趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05）。10 TCID50与20 TCID50之间，20 TCID50与40 TCID50之间，培养24，48，72 h时趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05）。同一浓度病毒，培养24 h与48 h之间趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05），培养48 h与96 h之间，72 h与96 h之间趋化作用差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与对照组（0μg／mL）比较，1.25μg／mL和12.5μg／mL地塞米松对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用无明显影响（P均＞0.05），其余质量浓度差异均有统计学意义（P均＜0.01）。结论：HCMV感染HELF后的培养上清具有趋化PBMC的功能，在一定质量浓度范围内，随着时间的延长趋化作用增强。地塞米松体外能够抑制病毒的趋化作用，且对PBMC的趋化抑制作用随着质量浓度的增加而增强。

人巨细胞病毒；炎症；地塞米松；趋化作用

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属β疱疹病毒亚科，为双链线状DNA病毒，常可引起孕妇宫内感染或围生期感染，导致胎儿或新生儿各种畸形和疾病。在免疫低下状态人群（如艾滋病、器官移植等患者）中，HCMV可引起致死性感染，危及生命［1］。HCMV可直接攻击和损伤宿主细胞。随着对病毒与细胞趋化性研究的深入［2］，HCMV趋化因子作用引起学者的广泛重视。我们前期小鼠体内研究也表明，HCMV感染可引发大量单核细胞和淋巴细胞浸润［3］。

HCMV具有编码趋化因子及其受体类似物的基因，其感染后所编码的趋化因子及其受体类似物，干扰机体正常的细胞因子及其受体的生理功能，参与某些巨细胞病毒疾病的病理改变，导致病毒在体内扩散、增殖和潜伏［4］；HCMV感染还可导致机体其他多种炎症因子的产生，如TNF-α、IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子（GSF）等［5］；IL-6和GSF参与HCMV感染相关的血管性疾病的形成。从致病机制而言，病毒除直接攻击宿主细胞致宿主损伤外，其编码的趋化因子及其受体类似物可通过促进机体相关炎症因子的释放，趋化活化炎症细胞至损害部位，加重宿主损伤。

炎症抑制因子通过抑制细胞合成和分泌炎症相关细胞因子、促炎因子等途径，抑制炎性细胞的浸润，从而抑制炎症的发生。地塞米松属于长效的糖皮质激素类药物，具有广泛的抗炎作用。那么，地塞米松是否能够影响HCMV感染所致的炎症反应？在HCMV感染后，应用地塞米松是否能抑制炎症细胞的趋化，进而减轻宿主的损害？因此，本实验在研究HCMV体外趋化PBMC功能的同时，设不同质量浓度的地塞米松研究其对HCMV趋化作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）由美国菌种保藏中心ATCC提供，按常规方法培养、传代，本实验采用第10～20代。PBMC按常规方法从健康志愿者外周血中提取、培养。

1.1.2 病毒 HCMV AD169株由安徽医科大学微生物教研室提供，按常规方法接种、传代、滴定，并测定半数组织培养感染量（tissue culture infective dose，TCID50）为10－4.6。

1.1.3 主要试剂 高糖DMEM、RPMI 1640均为Gibco公司产品，新生小牛血清、胎牛血清均为杭州四季青公司产品，人外周血淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品，PBS、胰蛋白酶均为Amresco公司产品，二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma公司产品，地塞米松注射液（5 mg／mL）为华中药业股份有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 CO2细胞培养箱（Heraeus公司），倒置显微镜（德国Leica公司），酶标仪（Anthos公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 检测地塞米松对HELF的毒性 收集对数期HELF，计数并调整细胞悬液浓度，加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，此时细胞密度约103～104／孔，边缘孔用无菌PBS填充，以防边缘效应。于37℃、5%CO2培养箱中培养至孔底铺满单层细胞，此时细胞密度约105／孔。将地塞米松注射液与含3%小牛血清的高糖DMEM（不加双抗）以不同比例混匀，配制成0.125，1.25，12.5，25，50，100，200μg／mL质量浓度的地塞米松溶液。将上述不同质量浓度梯度的地塞米松依次加入96孔板中，每孔200 μL。设不加地塞米松的HELF组为正常对照组，加不同质量浓度地塞米松的HELF为实验组，每组各设5个复孔。调零孔则加入200μL培养液。于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天显微镜下观察细胞毒性变化。约4 d后，弃培养液，加MTT染色液，20 μL／孔（质量浓度为5 mg／mL）。于37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，肉眼可见细胞中有蓝紫色甲赘结晶形成，弃染色液，加DMSO，100μL／孔。避光低速振荡10 min，使蓝紫色甲赘结晶充分溶解，室温下静置5 min，于酶标仪490 nm处测各孔光密度（D）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝实验组平均D值／对照组平均D值×100%。换算出地塞米松对HELF的半数中毒浓度（TC50），推算出最大无毒浓度（TC0），实验重复3次［6－7］。

1.2.2 PBMC的提取与培养 取新鲜肝素抗凝人外周全血30 mL，与PBS等体积混匀。取15 mL离心管数个，每管加入6 mL淋巴细胞分离液，小心地沿管侧壁注入6 mL经PBS稀释后的外周血，使其处于分离液液面之上。以2 000 r／min离心20 min，此时离心管内由上而下细胞分4层：血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明的淋巴细胞分离液层、红细胞层。轻轻吸取第2层约1～2 mL，移至另一离心管中。加入5 mL PBS，充分混匀，以2 000 r／min离心20 min，弃上清，反复清洗沉淀2次，以去除淋巴细胞分离液、血小板等杂质，得到所需细胞。用1 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，取10μL于细胞计数板，显微镜下计数，每1 mL外周全血可得到106～107个PBMC。将细胞悬液加入培养瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1 d备用。

1.2.3 HCMV体外感染HELF 取数块已铺有单层HELF的24孔板，每块板分别加入5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50的HCMV AD169毒株，37℃、5%CO2培养箱中吸附1.5 h，更换等量细胞维持液（含3%小牛血清的高糖DMEM）。分别于24、48、72、96 h终止培养。每次终止培养时，每板各取3孔感染上清，4℃，12 000×g离心30 min，以去除上清液中的病毒及细胞碎片［8］。

1.2.4 趋化性实验 将上述离心后上清分别加入24孔5μm Transwell趋化板的下室。将“1.2.2”中获得的PBMC，用不含血清的RPMI 1640培养液配置成约106／mL的细胞悬液，加入Transwell趋化板的上室，每孔100μL。将趋化板置于37℃、5% CO2培养箱中培养1.5 h。于显微镜下计数落入下室中的PBMC；每孔随机选取5个高倍视野，计算细胞总数。每组均设3个复孔［5］。选出趋化作用最强时的病毒浓度及培养时间。

1.2.5 地塞米松对HCMV感染上清趋化作用的影响 在呈单层贴壁生长的HELF 24孔细胞培养板中，接种“1.2.4”中选出的HCMV，吸附1.5 h后，更换含不同质量浓度地塞米松的DMEM，每个实验小组均各设3个复孔。于37℃、含5%CO2培养箱中培养数天后，收集各培养上清，4℃12 000×g，离心30 min，重复“1.2.4”的方法检测各组对PBMC的趋化实验。

1.2.6 灭活病毒感染上清的趋化作用 在铺有单层HELF的24孔板中，分别接种灭活HCMV（经紫外线照射10 min）、“1.2.4”选出的HCMV，吸附1.5 h后，更换DMEM细胞维持液。同时设正常HELF细胞为对照组。每组均各设3个复孔。于37℃、含5%CO2培养箱中培养数天后，收集各培养上清，离心后重复“1.2.4”的趋化实验。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 地塞米松对HELF细胞的毒性作用

结果如图1所示，地塞米松在100μg／mL以下时对HELF细胞无明显的毒性作用，而大于100μg／mL时，细胞毒性作用明显，镜下表现为细胞数量减少，形态不一，甚至坏死脱落。根据细胞存活率得出地塞米松的TC0为100μg／mL；根据Probit回归法计算出地塞米松的TC50为92.05μg／mL。

图1 地塞米松对HELF细胞的毒性作用

2.2 HCMV感染HELF后的上清趋化PBMC的作用

比较不同浓度的病毒培养上清在不同培养时间下对PBMC的趋化作用，结果显示，5 TCID50与10 TCID50之间，80 TCID50与1 00 TCID50之间，1 00 TCID50与1 000 TCID50之间，培养24，48，72，96 h时趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05）。10 TCID50与20 TCID50相比，20 TCID50与40 TCID50相比，培养24，48，72 h时趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05）。同一浓度病毒，培养24 h与48 h之间趋化作用差异均无统计学意义（P均＞0.05），培养48 h与96 h之间，72 h与96 h之间趋化作用差异均有统计学意义（P均＜0.05），除10 TCID50外，培养48 h与72 h之间趋化作用均有统计学意义（P均＜0.05）。

由图2可见，HCMV感染HELF后的上清具有趋化PBMC的作用，且在一定范围内（5 TCID50～80 TCID50），随着病毒浓度的增加，趋化作用增强；当浓度超过80 TCID50时，趋化强度增加则不明显；随着培养时间的延长，尤其是在72，96 h，趋化作用也不断增强。所以，我们选择80 TCID50浓度的病毒，培养时间为96 h，进一步实验。

图2 不同培养时间下细胞迁移数与病毒浓度的关系

2.3 地塞米松抑制病毒上清对PBMC的趋化作用

如图3所示，与对照组（0μg／mL）比较，1.25 μg／mL和12.5μg／mL地塞米松对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用无明显影响（t1.25＝－0.09，t12.5＝－1.80，P均＞0.05），其余质量浓度地塞米松与对照组相比，差异均有统计学意义（t25＝－5.23，t50＝－8.66，t100＝－12.7，P均＜0.01），提示地塞米松对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用具有一定的抑制作用，且随着地塞米松质量浓度的增加，趋化作用减弱（F值＝52.75，P＜0.01）。

图3 地塞米松质量浓度与HCM V上清趋化作用的关系

2.4 灭活病毒感染上清介导的PBMC趋化作用弱于正常病毒感染上清

与正常病毒感染上清介导的PBMC趋化作用比较，灭活病毒感染上清介导的趋化作用明显减弱，正常细胞＋灭活HCMV组中迁移细胞数约为正常细胞＋80 TCID50HCMV组的1／3。正常细胞＋80 TCID50HCMV组中迁移细胞数约为正常细胞组的4.5倍。

3 讨论

近来研究表明，炎症反应在HCMV感染的发病机制及病情进展的过程中发挥重要作用。本实验旨在从整个病毒培养上清的角度，研究其趋化作用。

HCMV具有编码趋化因子及其受体类似物的基因，包括UL128、UL146和UL147等趋化因子类似物基因，US27、US28、UL33和UL78等趋化因子受体类似物基因［9］。研究显示，HCMV编码的趋化因子类似物属于分泌性、亲水性蛋白［10］。本实验可推测，病毒感染上清中可能存在HCMV编码的趋化因子或其受体类似物。在对UL146的研究中发现，从HCMV Toledo株感染后72 h开始，病毒基因转录编码的UL146基因产物显著增多［8］。本实验结果显示，HCMV介导的趋化作用在72 h和96 h显著增加（图2），据此可推测，病毒编码的趋化蛋白主要为病毒晚期基因产物。

Transwell趋化板分上、下室，中间以一层薄膜分隔，巧妙地模拟了体内环境血管壁分隔的组织细胞与血细胞。本实验证实了HCMV感染后的上清具有趋化PBMC的功能。结果显示，并不是病毒浓度越高，趋化作用越强，80、1 000 TCID50病毒趋化作用差异无统计学意义。可能的原因如下：病毒浓度过高，抑制正常细胞的生长，甚至破坏细胞结构，使其裂解，进而病毒复制表达的能力受到抑制，产物蛋白的量也受到影响；Transwell上室PBMC的量是一定的，所以相应的趋化因子受体的量也是有限的，在一定范围内，病毒浓度越高，蛋白产物也越多，但是受体饱和时，趋化作用的差异就无统计学意义了。

地塞米松是一种临床常用的长效糖皮质激素类药物，具有广泛的抗炎作用，除了对骨关节炎、创伤性中耳炎、急性肝损伤等引起的相关炎症反应具有抑制作用，对病毒所致的炎症反应也有影响，如病毒性脑炎、病毒性角膜炎等。本实验证实地塞米松对HCMV感染后的上清趋化PBMC的功能具有一定的抑制作用，因此提示，当病毒感染时，使用激素要特别注意，否则会抑制机体单核细胞的免疫功能，加重病情；但其具体抑制机制不明，可能与其对病毒编码的趋化分泌蛋白功能的影响、抑制HELF细胞增殖、促凋亡、影响细胞钠通道［11］等有关，有待进一步研究。

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Chemotactic effect of human cytomegalovirus to peripheral blood mononuclear cells in vitro

WEIWei1，GU Shao-qing2，LIWen-jing1，MA Xiao-meng1，ZHAO Yuan1
（1.School of ClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Departmentof Pediatrics，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To explore the chemotactic effectof human cytomegalovirus（HCMV）on peripheral blood mononuclear cells（PBMC）in vitro，and the influence of dexamethasone on chemotaxis.M ethods：We took different concentrations（5，10，20，40，60，80，100，1 000 TCID50）of HCMV AD169 to vaccinate human embryonic lung fibroblast cells（HELF），and extracted culturemedia supernatant，which was used to attract PBMC at 24，48，72，96 h.Then we observed and counted themigratory PBMC under high power lens of themicroscope，and compared the strength of chemotaxis.We also added dexamethasone at different concentrations（0.125，1.25，12.5，25，50，100μg／mL）to infect HELF as control.Results：Therewere no difference in chemotaxis among different concentration of HCMV between 5 TCID50and 10 TCID50，80 TCID50and 1 000 TCID50，1 00 TCID50and 1 000 TCID50among 24，48，72，96 h（both P＞0.05）.The chemotactic effect of HCMV between 10 TCID50and 20 TCID50，20 TCID50and 40 TCID50，among 24，48，72 h had no statistical difference（both P＞0.05）.Compared with the control goup（0μg／mL），the chemotaxis of culturemedia supernatant of the dexamethasone at 12.5μg／mL and 12.5μg／mLhad no statistical difference（both P＞0.05），while dexamethasone at 25，50，100μg／mL had statistical difference（both P＜0.01）.Conclusion：The supernatant of HCMV infected HELF had chemotaxis to PBMC，which was increased with the culture time increasing.Dexamethasone could restrain inhibitory effect on chemotaxis，which was increased with the drug concentration increasing.

human cytomegalovirus；inflammatory response；dexamethasone；chemotactic effect

R373.11

A

1671－7783（2014）03－0226－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140028

韦苇（1988—），女，硕士研究生；顾绍庆（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：gsqcc＠sohu.com

2014－01－15 ［编辑］ 刘星星