刘旭，郭文洁，黄丹民，2，高静

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.马来西亚百年生命科技有限公司，吉隆坡57000）

鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠Heps肝癌的抑制作用

刘旭1，郭文洁1，黄丹民1，2，高静1

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.马来西亚百年生命科技有限公司，吉隆坡57000）

目的：研究鳄嘴花正丁醇提取物［Clinacanthusnutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts，CN-N］对荷瘤小鼠的体内抑瘤作用及延长生存时间作用。方法：肝癌细胞接种至ICR小鼠右侧腋下，建立Heps小鼠肝癌模型，随机分成4组，对照组、环磷酰胺组、CN-N低剂量组（3 mg·kg－1·d－1）、CN-N高剂量组（10 mg·kg－1·d－1），每组10只，观察CN-N对荷瘤小鼠的抑瘤率、体质量、脾脏及胸腺指数、生存时间的影响。蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达，TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果：与对照组比较，CN-N低剂量组和高剂量组肿瘤质量明显降低（t分别为2.261，3.140，P均＜0.05），荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数差异无统计学意义（P均＞0.05），PCNA表达均明显减少；CN-N高剂量组生命延长率为54.8%，较对照组明显延长荷瘤小鼠生存期（t＝3.416，P＝0.003 1）。结论：鳄嘴花正丁醇提取物具有良好的抗肿瘤作用，高剂量CN-N能提高荷瘤小鼠的生存期。

鳄嘴花；正丁醇提取物；抗肿瘤；细胞凋亡

肝癌是全世界最普遍最致命的恶性肿瘤之一，且治疗手段非常有限［1］。目前，肝癌的治疗方法主要为外科手术切除及肝移植，但只适用于10%～25%的患者［2］，因为大部分患者被确诊时已是肝癌晚期［3］。治疗肝癌的一线药物主要有有5-氟尿嘧啶、长春新碱、环磷酰胺、顺铂和阿霉素等，但大多是非选择性的细胞毒药物，毒副作用强［4］。大部分肝癌患者因条件限制无法接受有效治疗，因此，研发高效低毒的抗肝癌新药极为必要。

鳄嘴花［Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau］属于爵床科鳄嘴花属，是泰国传统药物中广泛应用的药用植物，分布于中南半岛、马来半岛以及我国的广西、广东、云南、海南等地。在马来西亚，泰国等地，鳄嘴花作为一种传统的药材用于治疗蛇叮咬，精神紧张，糖尿病，类风湿关节炎，肝炎以及抗病毒等。鳄嘴花氯仿提取物对肿瘤细胞有显著的抑制作用［5］，但鳄嘴花正丁醇提取物（Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts，CN-N）是否有抗肿瘤作用，未有公开报道。本研究旨在建立小鼠Heps肝癌实体瘤模型，探讨CN-N的抗肿瘤效果并初步研究其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用小鼠肝腹腔积液瘤Heps细胞由江苏省肿瘤医院提供，小鼠腹腔积液传代；注射用环磷酰胺购自通化茂祥制药有限公司（产品批号130601）；TUNEL试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；β-肌动蛋白、PCNA抗体购自Santa Cruz公司。

环磷酰胺用生理盐水配成2 mg·mL－1的溶液，备用；鳄嘴花由马来西亚百年生命科技有限公司提供。鳄嘴花全株干品粉末1.5 kg，于5 L 95%乙醇浸泡2周，抽滤取滤液，料渣烘干，95%乙醇提取2次，料液比分别为1∶5，1∶3，时间分别为2.5、2 h，抽滤取滤液。料渣烘干，用60%乙醇提取2次，料液比分别为1∶5，1∶3，时间分别为2.5、2 h，抽滤取滤液。合并所有滤液，浓缩得浸膏。冷冻干燥得干粉，正丁醇提取，冷冻干燥得干粉，配成所需浓度，备用。

1.2 动物分组及处理

ICR小鼠94只，SCXK（苏）2013-0011，4～5周龄，体质量18～22 g，由江苏大学动物中心提供；建立肿瘤皮下移植瘤模型［6］：在腹腔积液瘤模型鼠腹腔内培养Heps腹腔积液瘤株，7 d后，将腹腔积液瘤模型鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡5 min，腹腔穿刺取腹腔积液，计数并用生理盐水稀释至细胞密度为2 ×107个／mL；取0.2 mL Heps（4×106个／只）瘤细胞悬液接种于ICR小鼠右侧腋下，48 h后，游标卡尺测量瘤体的长径和宽径，计算肿瘤体积。

将造模成功的小鼠根据肿瘤体积平均分成4组，每组11只，分别为对照组，环磷酰胺组，CN-N低剂量组，CN-N高剂量组；分别给予生理盐水，20 mg／kg环磷酰胺，3、10 mg／kg CN-N。环磷酰胺组于腹腔注射给药，其余组灌胃给药，每只小鼠的注射量均为0.2 mL，1次／d，连续11 d。每天观察小鼠的生长、体质量、饮食和活动度；游标卡尺测量肿瘤长径（a）和宽径（b），计算肿瘤体积，V＝1／2·a·b2。

11 d后颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤，称重。取小鼠脾脏、胸腺并称重。计算公式：抑瘤率（%）＝（对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）／对照组平均瘤重×100%；脾脏指数＝脾脏质量（g）／体质量（g）；胸腺指数＝胸腺质量（g）／体质量（g）。

1.3 生命延长实验

实验方法同上，将造模成功的50只ICR小鼠根据肿瘤体积平均分成5组，每组10只，分别为对照组，环磷酰胺组，CN-N1组，CN-N2组，CN-N3组；分别给予生理盐水，20mg／kg环磷酰胺，1、3、10mg／kg CN-N，方法同“1.2”。记录小鼠死亡天数，绘制存活曲线，计算延长率，延长率＝（给药组平均存活时间－对照组平均存活时间）／对照组平均存活时间。

1.4 肿瘤组织形态学观察

取肿瘤组织，4%低聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片。苏木精 伊红（HE）染色，普通光镜下观察肿瘤组织坏死，血管充血等情况。

1.5 TUNEL法检测肝癌细胞凋亡

实验方法参照TUNEL试剂盒说明书进行。

我国政府必须加快完善社会保障体系，逐步提高中央和地方财政对社会保障的支出比重；统筹推进国家基本养老保险、企业补充养老保险和个人储蓄性养老保险体系改革；完善失业保险制度，扩大覆盖面；积极稳妥地推进城镇医疗保障制度改革；推进农村社会保障工作并对老弱病残、鳏寡孤独等实行社会救济，建立新型农村合作医疗和医疗救助制度。建立包括养老、医疗、失业、工伤和生育保险在内的社会保障体系，使全体人民学有所教、劳有所得、病有所医、老有所养、住有所居，推动以改善民生为重点的和谐社会建设，使改革发展的成果惠及更多的劳动者。

1.6 蛋白质印迹法检测PCNA的表达

取“1.2”中对照组，CN-N低剂量组（3 mg／kg），CN-N高剂量组（10 mg／kg）肿瘤组织，每组随机抽取3个样，提取蛋白，BCA法测定蛋白含量。进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜，封闭后分别加入β-肌动蛋白、PCNA，4℃孵育过夜，洗膜以后加入对应二抗，室温摇床孵育2 h后，TBST洗3次，每次10 min。ECL发光剂显示阳性条带，在Typhoon分子成像系统上记录结果。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 CN-N对Heps肝癌生长的作用

给药第11天时存活小鼠的肿瘤形态见图1。肉眼观，与对照组相比，其他3组肿瘤体积减小。给药到第11天时，环磷酰胺组小鼠死亡3只。环磷酰胺组，CN-N低剂量组，CN-N高剂量组3组抑瘤率分别为73.4%，41.0%，61.7%，与对照组比较，肿瘤质量明显降低（F＝9.069，P＝0.001）。与CN-N低剂量组比较，CN-N高剂量组肿瘤质量更低（t＝2.695，P＝0.013 6）。从第3天开始，给药组肿瘤体积增速放缓。从第4天开始，药物显著抑制肿瘤生长，表明CN-N有明显的抑制肿瘤生长的作用，且高剂量效果更佳。见图1。

图1 鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠肿瘤生长的作用

2.2 CN-N对小鼠体质量及免疫器官指数的影响

与对照组比较，CN-N低剂量组和高剂量组小鼠体质量差异无统计学意义，表明CN-N对小鼠体质量没有明显抑制作用。见图2。

与对照组比较，环磷酰胺组荷瘤小鼠的脾脏指数明显降低（t＝3.914，P＝0.000 9），CN-N低剂量组和高剂量组荷瘤小鼠脾脏指数差异无统计学意义（t＝0.3012，1.366，P均＞0.05），初步表明CN-N对荷瘤小鼠脾脏可能没有明显的毒副作用。见表1。

与对照组比较，环磷酰胺组胸腺指数明显降低（t＝4.549，P＝0.000 2），CN-N低剂量组和高剂量组荷瘤小鼠胸腺指数差异均无统计学意义（t＝0.685 1，0.5055，P均＞0.05），初步表明CN-N对荷瘤小鼠胸腺可能没有明显的毒副作用。见表1。

图2 鳄嘴花正丁醇提取物对荷瘤小鼠体质量的影响

表1 各组小鼠去瘤体质量及免疫器官指数的比较n＝10，±s

表1 各组小鼠去瘤体质量及免疫器官指数的比较n＝10，±s

a：P＜0.05，与对照组比较

组别 去瘤体质量（g） 脾脏指数（%） 胸腺指数（%）25.0±3.6 0.64±0.21 0.34±0.17环磷酰胺组 20.7±2.0a 0.37±0.08a 0.095±0.05a低剂量组 24.0±2.4 0.66±0.21 0.38±0.10高剂量组 23.9±1.7 0.54±0.12 0.37±0.11 F值对照组0.001 5 0.000 5 0.000 1 6.163 7.389 15.59 P值

2.3 CN-N对荷瘤小鼠的寿命延长效果

对照组，环磷酰胺组，CN-N1组、N2组、N3组存活时间分别为（19.9±5.9）d，（29.9±7.2）d，（21.8±7.1）d，（25.4±7.2）d，（30.8±10.4）d（F＝4.716，P＝0.002 9）。环磷酰胺组延长率达50.3%，较对照组显著延长荷瘤小鼠生存期（t＝3.465，P＝0.002 8）；CN-N1组和N2组延长率分别为9.5%，27.6%，与对照组比较差异均无统计学意义（t＝0.667 8，1.909，P均＞0.05）；CN-N3组延长率为54.8%，与对照组比较延长作用明显（t＝3.416，P＝0.003 1）。结果表明，CN-N高剂量可明显延长荷瘤小鼠的存活时间。见图3。

2.4 各组肿瘤组织的形态结构

对照组肿瘤细胞体积大，呈多边形或类圆形，细胞核大深染，核质比增大，核分裂象易见。肿瘤细胞密集排列呈实体团块，浸润于周围的肌肉和脂肪组织内。肿瘤间质无明显炎细胞浸润，可见充血、出血现象，多数为轻、中度。环磷酰胺组肿瘤细胞形态与对照组相同，但肿瘤细胞异型性明显，肿瘤凋亡和（或）坏死程度较对照组明显，肿瘤间质无明显炎细胞浸润，充血、出血较对照组轻。CN-N给药组肿瘤细胞形态与对照组相同，肿瘤凋亡和（或）坏死程度较对照组明显，并且呈一定剂量依赖的趋势。见图4。

2.5 肿瘤组织凋亡情况

结果显示，对照组凋亡不明显，环磷酰胺组凋亡明显，CN-N低剂量组凋亡较对照组多但较环磷酰胺组少；CN-N高剂量组凋亡同环磷酰胺组，表明CN-N可能引起肿瘤细胞的凋亡从而发挥抗肿瘤作用。见图5。

2.6 蛋白质印迹法检测CN-N对PCNA的影响

结果显示，CN-N给药组PCNA表达量低于对照组，且高剂量组表达比低剂量组更低，表明CN-N能够降低PCNA的表达。见图6。

图3 鳄嘴花正丁醇提取物对荷瘤小鼠存活时间的影响

图4 各组肿瘤组织的形态结构（HE染色×100）

图5 TUNEL法检测细胞凋亡结果（×100）

图6 各组PCNA蛋白的表达

3 讨论

全球每年有超过50万患者被确诊患有肝癌［7－8］。临床上治疗肝癌的药物以化疗药物为主，但其毒副作用较大。在预防肝癌发生，减轻患者痛苦，提高生存质量，延长生存时间等方面，植物来源的药物有独特的优势。其中，紫杉醇、长春新碱、鬼臼毒素是较成功的抗肿瘤药物，例如，拓扑替康和伊立替康（喜树碱半合成的衍生物）用于治疗卵巢癌、小细胞肺癌和结肠癌［9－10］。

在泰国、马来西亚等东南亚国家，鳄嘴花作为一种传统草药用于治疗带状疱疹、蚊虫叮咬、肝炎和蛇咬伤，其主要成分有豆甾醇，羽扇豆醇，β-谷甾醇，桦木醇，异牡荆素，6种碳苷黄酮和牡荆素等；其中，羽扇豆醇、桦木醇、异牡荆素有抗肿瘤作用，这为本研究提供了一定基础。本实验表明，CN-N对异体移植瘤有很好的抑制作用，给药后第3天开始，肿瘤体积增长速度放缓。给药11 d后，高剂量组抑瘤率高达61.7%。

生存期的延长是考察抗肿瘤药的一个重要指标，本实验显示CN-N高剂量组荷瘤小鼠的生存期明显延长，生命延长率达54.8%，显示出CN-N具有较好的应用前景。

CN-N对小鼠去瘤体质量、胸腺指数、脾脏指数无影响，不排除其有较小毒副作用的可能。CN-N显示出了良好的抗肿瘤作用，其抑瘤作用可能与诱导凋亡和抑制细胞增殖有关，但其有效成分到底是什么，以及诱导凋亡、抑制细胞增殖的分子机制还有待进一步研究。

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Inhibitive effect of Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts on Heps hepatoma in m ice

LIU Xu1，GUOWen-jie1，HUANG Dan-min1，2，GAO Jing1
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China；2.Bio Nice Industry Sdn Bhd，Kuala Lumbur 57000，Malaysia）

Objective：To investigate the anti-tumor activity and life extention effect of Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extract（CN-N）on tumor loaded mice.M ethods：Mice hepatoma carcinoma cells（Heps，grown in donormice）were transplanted subcutaneously into armpit of the ICR mice to establish the tumor xenograftsmodel.Tumormicewere randomized into four groups：control group，cytoxan group，CN-N low dose group（3 mg·kg－1·d－1），CN-N high dose group（10 mg·kg－1·d－1）.Tumor inhibition rate，bodyweights，immune organs index and life-prolonging effectwere recorded.Proliferation of tumor cellswere detected by western blotting and apoptosiswas examined by TUNEL assay.Results：Compared with the control group，CN-N low dose group and high dose group showed remarkable inhibition of tumor weight（t＝2.261，3.140，both P＜0.05）；no significant differences on spleen and thymus index of tumor-bearingmice（both P＞0.05）.PCNA expression levelswere greatly reduced when treated with low or high concentration of CN-N.Compared with the control group，CN-N high dose group significantly extended the survival time（t＝3.416，P＝0.003 1）.Conclusion：CN-N exhibited good antitumor activity and significantly prolonged the survival time of the tumor-bearingmice.

Clinacanthus nutans；n-butanol extracts；antitumor；apoptosis

R965

A

1671－7783（2014）03－0211－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140002

刘旭（1988—），男，硕士研究生；高静（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：jinggao＠ujs.edu.cn

2014－01－17 ［编辑］刘星星