江明殊，王跃华，刘 涛，刘 婷，孙 娜，王晓霞

(1.成都大学 生物产业学院，四川 成都 610106;2.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610101)

0 引 言

川贝母为百合科贝母属多种植物的干燥鳞茎，其包括川贝母、暗紫贝母、梭砂贝母和甘肃贝母等［1－2］.川贝母中含有多种类型化学成分，现代研究表明，总生物碱是其主要有效成分，其药理活性广泛，具有镇咳、祛痰、平喘等功效［3－5］.近年来，野生川贝母药材资源日益匮乏，药材质量不断下降，采用组培技术对川贝母进行培育已成为行业的热点.本课题组前期利用组培技术成功培育出了大量产质较优的川贝母，为了更好地控制组培川贝母的质量，本研究按照《中国药典》2010 版一部川贝母项下标准，对组培川贝母质量进行了研究，以期为其质量评价和控制提供相关依据.

1 仪器与试药

1.1 仪 器

实验所用仪器包括:FA－2004 型分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)，BS－6KH 型电子天平(上海友声衡器有限公司)，KQ－100 型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，SX－2.5－10 型马弗炉(北京中兴伟业仪器有限公司);水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，坩埚(常规)、干燥器(常规)、无灰滤纸、薄层板、毛细管.

1.2 药品及试剂

实验所用药品包括:组培川贝母由本课题组自主 培 育(批 号，20130528、20130412、20130326、20130619、 20130618、 20130405、 20130723、20130909、20130830、20131025);贝母素甲(批号，20110825)、贝母素乙(批号，20110416)由中国食品药品检定研究所提供.

实验所用试剂包括:乙醇(95%)(分析纯AR)(批号，20110823)、甲醇(分析纯AR)(批号，20100213)、三氯甲烷(分析纯 AR)(批号，20110524)、浓氨水(分析纯AR)(批号，20120220)、氢氧化钠(分析纯AR)(批号，20090228)、硅胶G 粉(分析纯AR)(批号，20120508)、羧甲基纤维素钠(分析纯AR)(批号，20110425)，均由成都市科龙化工试剂厂生产;实验用水为超纯水.

2 方法与结果

2.1 检 查

2.1.1 总灰分测定.

组培川贝母总灰分按照《中国药典》2010 版附录IXK 项下方法进行测定，结果见表1.

表1 总灰分测定

根据测定结果，规定本品灰分不得超过2%.

2.1.2 酸不溶性灰分测定.

组培川贝母酸不溶性灰分按照《中国药典》2010 版附录IXK 项下方法进行测定，结果见表2.

表2 酸不溶性灰分测定

根据测定结果，规定本品酸不溶性灰分不得超过1%.

2.2 浸出物测定

组培川贝母浸出物按照《中国药典》2010 版附录XA 项下方法测定，用稀乙醇作溶剂:称取组培川贝母粉末2 g，精密称定，置150 mL 锥形瓶中，精密加53%乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1 h 后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷后取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用53%乙醇补足减失重量，摇匀，用干燥器滤过，精密量取滤液25 mL置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算浸出物含量，结果见表3.

表3 浸出物测定

根据测定结果，确定本品浸出物不得少于20%.

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 对照品溶液制备.

取贝母素甲、贝母素乙对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，制得对照品溶液.

2.3.2 供试品溶液制备.

取组培川贝母细粉末(批号，20130528、20130619、20130723、20130830)10 g，加浓氨试液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超声1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL 溶解，制得供试品液.

2.3.3 点样、展开、显色.

吸取上述对照品溶液各2 μL、供试品溶液1 ～6 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯—甲醇—浓氨水试液—水(18∶ 2∶ 1∶ 0.1)为展开剂展开，依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液对组培川贝母进行显色鉴别.结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，呈现相同颜色的斑点.

2.4 生物碱含量测定

2.4.1 对照品溶液制备.

对照品溶液按照《中国药典》2010 版一部中川贝母项下方法制备:取西贝母碱5 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加入三氯甲烷至刻度，摇匀，制得对照品溶液.

2.4.2 供试品制备条件选择.

在确定供试品的制备方法时，本实验分别采用了超声和回流2 种方法，发现回流方法效果较好.同时，还考察了以1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1 为三氯甲烷—甲醇混合比以及当回流温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃和回流时间为1 h、2 h、3 h 时，对川贝母总生物碱含量的影响.最终确定:当三氯甲烷—甲醇混合比为4∶ 1，温度为80 ℃，回流2 h 时，制备出的川贝母供试品总生物碱含量最高，此与《中国药典》2010 版的结果一致.

2.4.3 供试品制备.

实验中，采用紫外分光光度法测定供试品的总生物碱含量:精密称取组培川贝母2 g 置具塞锥形瓶中，加浓氨液3 mL，浸润1 h，加三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液40 mL，置80 ℃水浴加热回流2 h，放冷滤过，滤液置50 mL 量瓶中，用适量三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液洗涤药渣2 ～3 次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液至刻度，摇匀;精密量取2 ～5 mL，置25 mL 具塞试管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL 使其溶解，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇，转移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，待用.以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法，在波长415 nm 处测定吸光度，用回归方程［7］计算其总生物碱的含量.

式中，A 为吸光度;n;稀释倍数;W 为试样质量g.

2.4.4 标准曲线的绘制.

精密量取“2.4.1”项下制备的对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 mL 置25 mL 具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇，转移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法，在波长415 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图1 所示.

图1 标准曲线

回归方程为，

Y=7.8171X－0.001，r=0.9999，

结果显示，取样量在0.004 99 ～0.035 07 mg 范围具有良好的线性关系.

2.4.5 精密度.

取“2.4.1”项下制备的对照品液6 份各0.4 mL置25 mL 具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再精密加溴甲酚绿2 mL，振荡后放置30 min，用分液漏斗分液并取续滤液，以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法，在波长415 nm 处测定吸光度，其RSD 为1.69%.实验结果表明，本方法精密度较好.

2.4.6 重复性.

取组培川贝母(批号:20130830)6 份，按“2.4.3”项下方法测定，其RSD 为0.675%.实验结果表明，本方法重复性较好.

2.4.7 稳定性.

取按“2.4.3”方法下制备的供试品液0.4 mL置25 mL 具塞试管中，补加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再加溴甲酚绿2 mL，闭塞，振荡后放30 min 后取续滤液，以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法，在波长415 nm 处，时间间隔为，0、30、60、90、120、180、240 min 时，测定吸光度，其RSD 为1.35%.结果表明，在所测时间内基本稳定.

2.4.8 加样回收率.

取已知含量的组培川贝母(批号:20130830)6份各2 g，再加入与所加样品等量的总生物碱对照品溶液，按“2.4.3”项下方法测定，计算加样回收率，结果如表4 所示.

表4 加样回收率实验结果(n=6)

表4 数据表明，本方法加样回收率符合规定.

2.4.9 组培川贝母生物碱含量测定.

取各批号组培川贝母，按照“2.4.3”项下方法进行测定，结果如表5 所示.

表5 组培川贝母生物碱含量测定结果

根据表5 测定结果，取其平均值的±20%为上下限，规定组培川贝母中总生物碱含量范围为0.20% ～0.30%.

3 讨 论

生物碱是川贝母主要的有效成分［8］，本研究在实验中也曾使用蒸发光散射法测定组培川贝母中的生物碱，但其色谱条件重复性较差，不符合相关技术要求，其液相测定方法有待进一步研究.最终还是参照《中国药典》2010 版一部中川贝母项下的紫外分光光度法对其生物碱进行含量测定.

通常，一种药材质量标准的建立还应该对其进行重金属、砷盐的检测，而本实验中所用到的实验材料属于组培物，通过人为控制其生长环境，使其在生长的过程中未受到来自重金属以及砷盐的污染，故不对其做相应的检测.

目前，关于川贝母的灰分测定中只包括总灰分，本实验在此基础上还增加了酸不溶性灰分检测.实验结果表明，组培川贝母的酸不溶性灰分不得超过1%，此为更好地控制川贝母的质量标准提供了依据.

川贝母为名贵的川产道地药材，常生长在海拔3 500 ～4 500 m 区域［9］，生长周期长，加之近几年过度采挖，导致野生川贝母资源日渐匮乏.有报道称，组培川贝母总生物碱含量几乎都高于野生川贝母鳞茎［10］，因此，利用组培技术能够在人为控制条件下快速获得大量品质优良的川贝母，此也是将药用植物从传统种植走向产业化生产的重要手段之一.但目前还未有报道给出组培川贝母的质量标准，因此，本实验在完成川贝母组培的基础上，建立了组培川贝母的质量标准，这有利于人们在今后的研究中对其进行质量控制.

［1］谢志民，王敏春，吕润霞.贝母类中药品种的本草考证［J］.中药材，2000，23(7):423－427.

［2］阎博华，丰芬，邵明义，等.川贝母基源本草考证［J］.中医研究，2010，23(3):69－71.

［3］YEUM H S，EE YC，KIM S H，et al.Fritillaria cirrhosa，Anemarrhena asphodeloides，Lee-Mo-Tang and cyclosporine a inhibitoval bumin-induced eosinophil accumulation and Th2-mediated bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma［J］.Basic Clinical Pharmacology ＆ Toxicology，2007，100(3):205－213.

［4］Li H J，Jiang Y，Li P.Characterizing distribution of steroidal lkaloids in Fritillaria spp.and related compound formulas by lliquid chromatography-mass spectrometry combined with hierarchial cluster analysis［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(11):2142－2149.

［5］Zhou J L，Xin G Z，Shi Z Q，et al.Characterization and dentification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217(45):7109－7122.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社，2010.

［7］匡菊香，刘龙忠，叶凤.半边莲总生物碱正交试验提取工艺［J］.中国民族民间医药，2009，20(6):43－44.

［8］王跃华，代勇，闫胜杰，等.卷叶贝母愈伤组织快速增殖条件的研究［J］.西南农业学报，2010，23(2):528－531.

［9］杨杨，姜虹，傅华龙，等.野生和组培川贝母总生物碱含量的测定和定位研究［J］.四川大学学报(自然科学版)，2008，45(1):209－213.

［10］吴玉良.川贝母流浸膏质量标准的研究［D］.成都:成都中医药大学，2012.