周婕 姚羚羚 靳先萍

肠道致病菌盲样考核鉴定分析与质量控制

周婕 姚羚羚 靳先萍

依据中华人民共和国国家标准GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008，采用传统分离方法和血清学鉴定，联合API20E细菌生化鉴定系统从混合盲样考核样本中分离出副溶血性弧菌，并对分离鉴定过程和微生物检验的质量控制进行总结分析。

肠道致病菌；沙门氏菌；副溶血性弧菌；盲样考核；质量控制

为加强实验室能力建设和提高在以后的工作中应对突发公共卫生事件的能力，成都市温江区疾病预防控制中心每年都会参加成都市疾病预防控制中心组织的微生物盲样考核工作，以此验证微生物实验室的仪器性能，培养基试剂质量和检验人员的检测能力。并从能力验证结果中找出自身与其它实验室间的差距，提升自身检测能力。现将2011年7月接受上级疾控中心盲样考核检测结果和检测过程分析如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质控样品来源 由成都市疾控中心发放的混合菌盲样。

1.1.2 培养基和试剂 本次实验所用培养基由杭州微生物、北京陆桥、法国科玛嘉试剂提供，API20E鉴定系统由法国梅里埃提供，沙门氏诊断血清由宁波天润提供。检测过程中使用的培养基和试剂均在有效期内，其生产厂家、批号、制备过程、验收贮存及使用前质控等信息均可溯源。

1.2 方法[1]中华人民共和国国家标准GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008。

1.2.1 增菌培养 取25mL样品放入225mL BPW增菌液中充分振荡混匀，放入培养箱中36℃增菌8h；另再取25mL样品放入225mL 3%碱性胨水培养8h，再将培养8h后的BPW增菌液混合后，分别移取1mL转种于10mL TTB和10mL SC增菌液中进行培养。同时直接用样品原液在选择性平板上直接划线分离，并在检测过程中同步代入待检菌标准菌株。

1.2.2 分离培养 挑取上述增菌液，分别接种于相应的鉴别培养基，36℃培养24h（BS培养48h）后，观察各个平板上菌落形态。

1.2.3 生化反应及血清分型 挑取不同特征菌落涂片染色镜检，同时挑取各种不同可疑菌落纯培养，再用纯培养物作系统生化鉴定和血清学试验。

2 结果

2.1 鉴别培养基上生长情况及菌落特点 见表1。

2.2 初步鉴定 分别挑取平板上可疑菌落于3%TSA和普通营养琼脂36℃纯培养24h，并进行革兰氏染色，再挑取纯培养的菌落进行氧化酶试验，进行细菌的初步鉴定。

2.3 可疑副溶血弧菌系统生化鉴定

2.3.1 3%三糖铁试验和氧化酶试验 可疑菌落在3%三糖铁上表现为上红下黄（-/+），硫化氢阴性，不产气，氧化酶为阳性。

表1 鉴别培养基上的菌落形态及生长情况

2.3.2 嗜盐试验 挑取3%三糖铁上的单个菌落，分别接种于不同浓度的氯化钠溶液中，36℃培养24h后观察结果。在3%和7%的Nacl胰胨水中混浊生长旺盛，在无盐胨水和10%的胰胨水不生长未混浊。

2.3.3 确定实验 取纯培养的菌落，制成菌悬液，用API20E进行鉴定，36℃培养24h观察结果。API20E试剂条生化反应编码为4346106，结果为Vibrio parahemolyticus，即为副溶血弧菌，鉴定百分率：99.9%，T=1.0。

2.4 可疑沙门氏菌系统生化鉴定

2.4.1 挑取6个BS平板上的墨绿色可疑菌落，接种三糖铁、赖氨酸、氧化酶、尿素、靛基质生化管，36℃培养24h观察结果，三糖铁反应结果只有一种，具体生化反应见表2。

表2 可疑菌株生化反应结果

2.4.2 血清学试验 挑取三糖铁上菌落做血清学试验，A-F多价不凝集（阴性），盐水对照也为阴性。

2.4.3 确定试验 取纯培养菌落，制成菌悬液，用API20E进行鉴定，36℃培养24h观察结果[2-3]。API20E试剂条生化反应编码为1604512，结果为Citrobacter youngae，即可排除沙门氏菌。

2.5 综上，由生化和血清学试验结果可得，本次质控考核检出副溶血弧菌，未检出沙门氏菌。

3 讨论

参加室验室间质控考核，可以增加检验人员实践经验，提高检测能力，在平常的食品微生物检测工作中，很少能分离出致病菌，所以对致病菌的检测缺少经验，而质控考核正好给了我们锻炼的机会。对于样品中有既目标菌，又混入了几种干扰菌的混合菌检测，在进行常规检验步骤之前，最好先直接用样品原液在相应的选择性平板上直接划线分离，这样做可以避免干扰菌生长过好而抑制了目标菌的生长，也可以提前了解样品中的目标菌的种类，到底是一种还是两种或是两种菌都存在。

培养基的选择也很重要，显色培养基是一种新型分离培养基，利用它进行微生物的筛选分离，其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基，使菌落特征更容易判断，大大提高了分离能力[3]。

平时做好实验室的质量控制工作，如培养基和诊断血清的质量控制、仪器的维护保养和检定校准、标准菌株的传代和安全管理。注意实验室生物安全，质控菌株多为致病菌，实验结束后所有培养物都必须要经过高压灭菌处理[4-6]。

[1] GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008 《中华人民共和国国家标准食品微生物学检验》[S].中华人民共和国卫生部,2010.

[2] 慕万志.2007年双塔区肠道致病菌质控盲样检测报告[J].预防医学情报杂志，2008,24(6):94-95.

[3] 宋凤燕,宋艳文.食源性致病菌质控盲样鉴定结果分析[J].职业与健康， 2010,8(23):60-61.

[4] 付冬莲,袁国辉.一次微生物混合考核盲样检测分析[J].实验与检验医学，2012,30（6）:628-630.

[5] 杨一明.微生物质控考核样品的检测分析与探讨[J].检验医学与临床，2011,8（23）:2941-2942.

[6] 张喜.商品微生物培养基质量状况及其控制[J].当代医学，2009,15 (16):37-38.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.104

四川 611130 成都市温江区疾病预防控制中心 （周婕 姚羚羚靳先萍）