王东 魏文平 王芳

依那普利对压力超负荷诱导的心肌纤维化的影响及microRNA-214的表达变化

王东 魏文平 王芳

目的 探讨压力超负荷导致心肌纤维化过程中microRNA-214的表达变化，以及依那普利对心肌纤维化的影响。方法 80只雄性SD大鼠随机分为压力超负荷组（Model，n=40），假手术组（Sham，n=40）。其中各组再随机分为两个亚组：依那普利治疗组（n=20）与无依那普利治疗组（n=20）。行腹主动脉缩窄术建立心脏压力超负荷大鼠模型。4周后，酶联免疫分析法测定各组大鼠血清中的PICP、ICTP、MMP-2、TIMP-2等心肌纤维化指标，荧光实时定量PCR技术检测的microRNA-214表达变化。结果 压力超负荷组大鼠的PICP为(161.3±16.3)ng/L、ICTP为(3.06±0.5)、PICP/ICTP 比值为(51.1±7.3)、MMP-2为(2638.2±289.6)pg/mL、TIMP-2为(4396±365.9)ng/mL，上述指标与假手术相比，均有所增高，差异具有统计学意义(P均<0.05)；模型组MMP-2/TIMP-2比值为(0.6±0.4)，显著低于假手术组（P<0.05），依那普利处理亚组的大鼠PICP为(114.1±19.6)ng/L、ICTP为(2.5±0.7)ng/ L、PICP/ICTP比值为(45.1±16.3）、MMP-2为(806.8±301.6)pg/mL、TIMP-2为(2052.6±322.3)，均低于单纯压力超负荷组，异具有统计学意义（P均<0.05）。依那普利处理亚组MMP-2/TIMP-2比值为(0.88±0.3)，显著高于单纯压力超负荷组，差异具有统计学意义(P均<0.05)。同时压力超负荷处理会导致microRNA-214的表达相对于假手术组增高（2.1±0.3）倍，依那普利处理可以缓解压力超负荷引起的microRNA-21过表达，但仍为假手术组的（1.5±0.2）倍。结论 依那普利可以缓解压力超负荷造成的心肌纤维化，microRNA-214与此过程有关，可作为心肌纤维化的治疗靶点或标志物。

压力超负荷；大鼠；依那普利；心肌纤维化；微小RNA-214

心肌纤维化是指心肌细胞外的基质大量沉积，胶原浓度和胶原容积(collagen volume fraction，CVF)显著增加，各型胶原代谢、排列紊乱，心肌纤维化影响心肌组织的结构和功能，如造成心肌肥厚，顺应性降低，舒缩功能障碍，它是心室重构的表现，心房颤动的诱因，最终导致心衰、心律失常[1]。由高血压等疾病引起心脏压力超负荷是心肌纤维化的主要原因，其机制为心脏压力超负荷可导致一系列的级联信号的瀑布激活，从而诱发胶原代谢障碍，但是该机制十分复杂，涉及分子众多，如能更加明确该机制，可为对抗压力超负荷导致的心肌纤维化提供治疗靶点[2]。近年来，除胶原代谢方面的机制得到了大量研究外，一些胶原代谢中的因子可以作为心肌纤维化的明确指标，如Ⅰ型前胶原羧基端肽（procollagen type I C-terminal peptide,PICP）、Ⅰ型胶原羧基端交联肽（Type I collagen cross-linked telopeptide, ICTP）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基质金属蛋白酶-2抑制剂(metallopeptidase inhibitor 2,TIMP-2)等[3]。此外，microRNA的研究也成为了研究热点，有研究发现microRNA-214在心肌缺血/缺氧损伤中存在高表达[4]，但其与压力超负荷导致的心肌纤维化是否有关还未见报道。大量研究已证实血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)类的药物可以减轻心肌纤维化、减少心室重构、改善心力衰竭预后[5]，本研究旨在结合上述胶原代谢指标，探索依那普利对压力超负荷诱导的心肌纤维化的影响及microRNA-214在此过程中的表达变化。

1 材料与方法

1.1 分组和处理方法 80只雄性SD大鼠（购自兰州大学动物实验中心）随机分为压力超负荷组（Model，n=40），假手术组（Sham，n=40）。其中各组再随机分为2个亚组：依那普利治疗组（n=20）与无依那普利治疗组（n=20）。依那普利（江苏制药股份有限公司）使用剂量为10mg/(kg·d)，灌胃方式给药，1次/d。压力超负荷组行腹主动脉缩窄术以建立压力超负荷模型。各组干预4周后处死，检测各组纤维化指标以及microRNA-214的表达变化。

1.2 纤维化指标的检测 大鼠处死后，立即打开胸腔，抽取3mL动脉血。酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠血清中的Ⅰ型前胶原羧基端肽（PICP）与Ⅰ型胶原羧基端交联肽（ICTP）的浓度检并计算PICP/ICTP比值。同时检测血清基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-2抑制剂(TIMP-2)浓度。

1.3 检测各组microRNA-214的表达变化 剪去心脏心室组织，冰上操作快速剪碎。用总RNA提取试剂盒（美国QIAGEN公司）提取组织中的总RNA，使用microRNA反转录试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司），按照所说明书构建反转录体系，将microRNA反转录为cDNA。使用GO Taq® qPCR Master Mix（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）对cDNA进行扩增，体系参照说明书。使用2-△△CT法分析各组的miR-214的相对表达情况。

1.4 统计学方法 使用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析，正态计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 相比假手术组，压力超负荷模型组下大鼠PICP水平增高、ICTP增高、PICP/ICTP比值增高。对于压力超负荷模型组来讲，依那普利治疗亚组血清PICP、PICP/ICTP的比值均显著降低，与非依那普利的压力超负荷模型组相比，差异具有统计学意义(P均<0.05)。假手术组两亚组之间的PICP、PICP/ICTP的比值差异无统计学意义。同时，压力超负荷模型组血清MMP-2水平、TIMP-2水平比假手术组显著提高(P均<0.05)。对于压力超负荷模型组来讲，依那普利治疗亚组血清MMP-2水平、TIMP-2水平均显著降低，MMP-2/TIMP-2的比值增高。与非依那普利的压力超负荷模型组相比，差异具有统计学意义(P均< 0.05)。假手术组各亚组的MMP-2水平、TIMP-2水平差异无统计学意义（见表1、表2）。

表1 各组大鼠PICP与ICTP血清水平

表2 各组大鼠MPP-2与TIMP-2血清水平

2.2 相比假手术组，压力超负荷模型组的miR-214表达水平明显提高，其中依那普利治疗亚组的miR-214表达相对于假手术组的依那普利治疗亚组提高了（1.5±0.2）倍，非依那普利治疗亚组的miR-214表达相对于假手术组的非依那普利治疗亚组提高了（2.1±0.3）倍。且差异均有统计学意义（P均<0.05）。假手术组中依那普利亚组的miR-214表达水平低于非依那普利亚组，差异有统计学意义（P<0.05，见图1）。

图1 各组大鼠miR-214的表达变化。注：Sham表示无依那普利治疗的假手术组，Model表示无依那普利治疗压力超负荷组，Sham+ena表示依那普利治疗的假手术组，Model+ena表示依那普利治疗的压力超负荷组。与无依那普利治疗的假手术组相比，aP<0.05。与无依那普利治疗的压力超负荷亚组相比，bP<0.05

3 讨论

压力超负荷导致心肌纤维化是确定的事实，本研究通过构建模型，制造压力超负荷条件后，检测各种心肌纤维化指标，确实提示有心肌纤维化的发生。压力超负荷可以通过激活多个因子及其涉及的信号通路来诱发心肌组织胶原代谢紊乱，引起心肌纤维化。这些因子或信号包括：EGR-1的表达、钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路、人体补体因子B的表达、Rho激酶信号通路[5-7]。而这些因子或信号通路都会受到善血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的激活，即血管紧张素Ⅱ的浓度从一定程度上来讲会增加心肌的纤维化，而实际上确有研究表明心肌纤维化的过程中存在AngⅡ水平的增高[5]。因而AngⅡ可作为心肌纤维化的指标，同时从另一个角度考虑，抑制AngⅡ的水平也许可以减缓心肌的纤维化。依那普利是血管紧张素转化酶抑制剂，可以降低AngⅡ的水平，本研究中，在压力超负荷的情况下，纤维化指标提示出较为旺盛的胶原代谢，并出现了失衡，即胶原的合成要大于分解，而依那普利的使用一定程度上恢复了这种失衡，表明其降低了压力超负荷造成的心肌纤维化。同时研究中发现，压力超负荷会导致microRNA-214的表达增高，依那普利的使用，在心肌降低纤维化的同时，降低了microRNA-214的表达，这提示microRNA-214除了与缺血/缺氧损伤有关外，还参与心肌纤维的发展过程，其次提示microRNA-214与AngⅡ具有一定的联系。microRNA-是一种微小RNA，微小RNA是真核生物中广泛存在的一种长约21～23个核苷酸的单链RNA分子，可调节多种基因的表达，进而影响细胞的分化、凋亡等活动[8]，但本研究尚未阐明microRNA-214在心肌纤维化中的具体作用，这需要在进一步的研究中探索。总之，本研究证实了，依那普利可以缓解压力超负荷造成的心肌纤维化，其机制microRNA-214的表达增高，microRNA-214可作为心肌纤维化的诊断指标或者治疗靶点，但其与心肌纤维化的关系需要更深入的研究。

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Objective To investigate the expression of microRNA-214 in the myocardial fibrosis induced by pressure-overloaded treatment and the effect of enalapril in this process. Methods 80 male Spargue Dawley rats randomly was divided two groups: sham-operation group (n=40) and pressure-overloaded group (n=40) ,each group was divided two subgroups: enalapril treatment subgroup (n=20) and without enalapril treatment subgroup (n=20). Using ELISA kits to detect the level of PICP, ICTP, MMP-2 and TIMP-2 in serum, furthermore qrt-PCR was used to analyzed the expression of microRNA-214. Results Compared with the sham group pressure-overloaded treatment can increase the level of PICP, ICTP, PICP/ ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 significantly[(161.3±16.3) ng/L, (3.06±0.5), (51.1±7.3), (2638.2±289.6 )pg/mL, (4396±365.9)ng/mL, P<0.05], after enalapril treatment the level of PICP, ICTP, PICP/ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 were decreased[(2.5±0.7)ng/L, (45.1±16.3), (806.8±301.6) pg/mL, (2052.6±322.3),P<0.05]. MPP-2/ TIMP-2 ratio was (0.6±0.4) that is the lowest in pressure-overloaded group , After enalapril treatmen, MPP-2/ TIMP-2 ratio was elevated to (0.88±0.3). Meanwhile pressure-overloaded treatment can induce microRNA-214 overexpression[(2.1±0.3) fold relative to Sham group] and enalapril can decreased the expression of microRNA-214[(1.5±0.2) fold relative to Sham group]. Conclusion Enalapril can relieve the myocardial fibrosis caused by pressure-overloaded treatment and microRNA-214, which may be a target or indicator for therapy of myocardial fibrosis, was involved in this process.

Pressure overload; Rat; Enalapril; Myocardial fibrosis; microRNA-214

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.003

甘肃 730000 兰州大学第一医院 （王东 王芳） 兰州石化总医院 （魏文平）

王芳 E-mail:wangf_lzu@163.com