王静静， 李新喜, 白 超, 王 洋, 田 野, 罗 军

(1新疆医科大学第一附属医院血管甲状腺外科, 乌鲁木齐 830054； 2新疆维吾尔自治区人民医院重症医学二科, 乌鲁木齐 830000)

血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)在动脉硬化闭塞症的病理生理过程中起重要作用，VEC作为种子细胞可促进缺血器官和肢体的血管新生，可能是未来治疗周围动脉缺血性疾病的方法之一[1]。VEC来源有限，诱导干细胞向VEC转化较为困难。本实验尝试诱导SD大鼠骨髓单个核细胞向VEC转化，探索诱导方式，并对被诱导出的VEC的生物学特性进行检测。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 雄性，4～6周龄，体质量150～180 g，SPF封闭群SD大鼠，由新疆医科大学医学实验动物中心提供[许可证号：SYXK(XJ)2003-0001]。饲养在消毒笼具中，每笼2只，在室温20～22℃饲养，明暗交替12 h，自由进食饲料。实验动物使用权以及实验技术路线经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查通过(证号：20080701007)。

1.1.2 试剂 M199培养基粉剂(Gibico公司)，澳洲胎牛血清(HyClone公司)，0.25%胰蛋白酶(HyClone公司)，大鼠淋巴细胞分离液Ficoll(天津灏洋生物公司)，重组血管内皮生长因子VEGF(Invitrogen 公司)，重组成纤维细胞生长因子( bFGF，R&D公司)，明胶(sigma公司)，von Willebrand Factor Monoclonal Antibody(Thermo公司)，Anti-von Willebrand Factor antibody FITC(Abcam公司)，CD34 Antibody PE(Novus)，mouse anti rat CD31 FITC(AbD公司)，mouse anti rat CD44 FITC，goat anti-mouse IgG secondary antibody (Thermo)，Hoechst33342(sigma公司)，Cell Counting Kit(CCK试剂盒)(上海锐赛生物公司)。

1.1.3 仪器 德国Leica正置显微镜(DMI5000B)，倒置显微镜(DMI4000B)及图形采集处理系统(Leica Application Surte，Version 2.8.1)，香港Heal Froce HF240 CO2培养箱，法国Jouan BR4离心机，苏州SW-CJ-2FD双人单面净化工作台，上海精宏DK-600S三用恒温水箱，离心机，美国BD公司流式细胞仪(FACScalibur)。

1.2方法

1.2.1 分离大鼠骨髓单个核细胞 SD大鼠颈部脱臼处死，75%酒精浸泡双下肢，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨[2-3]，剪去骨两端，注射器吸取5 mL M199培养基冲出骨髓细胞,用4号注射针头吹打细胞悬液,制备成单细胞悬液。……