许安萍，唐银杉，陈万顺，莫雨平，姚海江，赛因朝克图，李志刚

(北京中医药大学，北京100029)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆减退为主要临床表现的神经系统退行性疾病，其病因和发病机制尚未完全明了。分子遗传学研究显示，AD 的发生及其病理变化过程与β 淀粉样前体蛋白(amyloid precuesor protein，APP)、载脂蛋白E(apolipoprotien E，ApoE)等基因的异常表达密切相关。APP 经分泌酶水解产生β 淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)，是AD 患者脑内特征性病理产物老年斑的主要成分［1］。而ApoE 既能促进脑组织中Aβ 的聚集，又能促进tau 蛋白过度磷酸化，形成神经元纤维缠结，被认为是与AD 相关的主要风险基因［2］。多项研究已表明［3-5］，电针治疗AD 有较好疗效。但不同电针对AD 的治疗作用途径及疗效是否有差异未见报道。本实验通过观察脉冲电针和音乐电针对SAPM8 小鼠学习记忆能力及大脑皮层APP 、ApoE mRNA 表达的影响，探讨电针治疗AD 的可能作用机制，并比较两种电针的疗效差异，为不同电针治疗AD提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

雄性快速老化小鼠亚系(Senescence accelerated mouse/prone8，SAMP8)小鼠，8 月龄，体质重(30 ±2)g，清洁级，共24 只。同背景、同月龄抗快速老化小鼠亚系(Senescence accelerated mouse/resistancel，SAMR1)小鼠8 只。购于天津中医学院第一附属医院实验动物中心，合格证号:SCXK(津)2008-001。实验动物单笼饲养，实验前适应性饲养1 周。动物饲养环境:温度(23 ±1)℃，湿度45%。

1.2 试剂与药物

Trizol 试剂盒(美国Invitrogen 公司)，M-MLV 反转录试剂盒、Oligd(T)、dNTP 、DNA Marker(日本Takara 公司)，SYBR mix(美国ABI 公司)，Real-time PCR 扩增试剂盒(中国北京中原领先科技有限公司)，PCR 引物(生工生物工程有限公司)。

1.3 仪器

韩氏穴位神经刺激仪HANS-202 型(南京济生医疗科技有限公司)，音乐电针治疗仪ZJ-12H 型(深圳市圣祥高科技有限公司)，Morris 水迷宫(中国医学科学院药物研究所)，实时荧光定量PCR 仪ABI 7500(美国ABI)，台式高速常温离心机5417C(德国eppendorf)，微量加样器Reference(德国eppendorf)，紫外分光光度仪Biophotometer(德国eppendorf )，恒温金属浴HB-202 (中国北京中西远大公司)，凝胶成像系统Gel Doc 2000(美国Bio-rad)。

2 方法

2.1 分组

SAMP8 小鼠随机分为模型组、脉冲电针组、音乐电针组，每组8 只，SAMR1 小鼠8 只，作为正常组。脉冲电针组:接受脉冲电针干预。音乐电针组:接受音乐电针干预。正常组、模型组接受与电针组相同方法的束缚。以上4 组同步进行实验，每天1 次，连续15 天。

2.2 针刺方法

取穴:参考《实验针灸学》［6］，选取百会穴、印堂穴及水沟穴。

针刺操作:以自制鼠套将小鼠束缚，用30 号1 寸毫针平刺进针，百会穴针尖向后头部、印堂穴针尖向鼻尖方向，进针深度为3 ～5 mm。脉冲电针组连接韩氏电针仪，疏波，电针频率为2 Hz，电压为2 V，电流强度为1 mA。音乐电针组连接音乐电针治疗仪，音乐选取健脑益智类，电流强度为1 mA，强度调节以动物保持安静不挣扎嘶叫为度。两组均留针20 min，起针后点刺水沟穴。

2.3 行为学检测

治疗结束后，用Morris 水迷宫法测定小鼠的学习记忆能力［7］。①隐蔽平台试验:通过训练小鼠游泳寻找平台，检测其学习能力。训练时先将动物置于平台上10 s，然后将小鼠在除平台所在象限外的其他3 个象限各选距水池中心相等的点作为入水点，分别将小鼠放入水中，记录其从入水至找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果60 s 内找不到平台，潜伏期记为60 s。每天各训练2 次，历时5 天。②空间探索试验:第6天，撤除平台，分别在3 个象限的入水点放入小鼠，记录小鼠60 s 内在目标象限(原平台象限)停留时间。

2.4 检测小鼠大脑皮层中APP、ApoE mRNA 的表达

采用实时荧光定量PCR 法检测。小鼠快速断头处死后迅速取出脑组织，于无菌工作台冰盘上分离出大脑皮层，放入无菌冻存管置于液氮中，然后转移至-80℃冰箱保存待测。①样本RNA 提取:将小鼠大脑皮层组织标本按Trizol 提取试剂盒说明操作提取RNA。②RNA 质量检测:用核酸紫外分光光度计测定经稀释的RNA 提取物的OD 值和浓度，判断其纯度。③样本cDNA 合成:按说明操作，用20 μL 反应体系，以Oligo(dT)1 μL 为引物，将RNA 反转录成cDNA，-80℃保存。④PCR 扩增:取2 μL cDNA 稀释后的标准品，用20 μL 反应体系进行PCR 扩增，扩增条件为:94℃预变性15 min，94℃15 s，60℃34 s，72℃15 s，共40 个循环扩增，最后72℃10 min 延伸。⑤引物序列:GAPDHF 上游引物5'- GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，下游引物5'- GACTGTGGTCATGAGTCCT-3'，片段长度136 bp。APP 上游引物5'- ACATGATCAGTGAGCCCAGA- 3'，下 游 引 物 5'- TCAACAGGCTCGACTTCATT-3'，片段长度187 bp。ApoE 上游引物5'-AGCCGACATGGAGGATCTAC-3'，下游引物5'- TGCCTTGTACACAGCTAGGC-3'，片段长度178 bp。⑥样本PCR 反应:应用ABI 7500 Real-Time PCR仪进行检测，测得目的基因的CT值。用比较CT值法分析结果［8］，ΔΔCT=(CT目的基因- CT内参基因)处理组-(CT目的基因- CT内参基因)正常组。

2.5 统计方法

应用SPSS19.0 进行统计学处理。组间差异比较，数据正态分布、方差齐时采用单因素方差分析LSD 检验，数据非正态分布和/或方差不齐时采用单因素方差分析Dunnett’sT3 检验，结果用均值±标准差(±s)表示，以P ＜0.05 为有统计学差异。

3 结果

3.1 不同电针对SAMP8 小鼠学习记忆能力的影响

3.1.1 隐蔽平台试验结果 如表1 所示，与正常组比较，模型组逃避潜伏期时间显著增加(P ＜0.05)，说明8 月龄SAMP8 小鼠已出现学习记忆衰退;与模型组比较，训练第4 天时音乐电针组逃避潜伏期明显下降(P ＜0. 05)，第5 天时脉冲电针组明显下降(P ＜0.05)。

表1 各组小鼠Morris 水迷宫实验逃避潜伏期比较(±s，单位:s)

表1 各组小鼠Morris 水迷宫实验逃避潜伏期比较(±s，单位:s)

注:与正常组比较，#P ＜0.05;与模型组比较，* P ＜0.05。

组别 例数 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5天正常组 8 51.54 ±4.84 47.16 ±9.00 38.52 ±4.35 36.23 ±6.27 37.61 ±4.80模型组 8 58.00 ±3.66# 54.26 ±7.37# 54.21 ±8.24# 52.77 ±7.69# 53.74 ±5.98#脉冲电针组 8 57.56 ±4.31# 53.58 ±8.18# 52.20 ±8.39# 51.14 ±3.95# 44.99 ±7.69*音乐电针组 8 55.90 ±5.57# 51.84 ±4.25# 47.42 ±6.87# 44.03 ±6.28* 40.41 ±6.38*

3.1.2 空间探索试验结果 如表2 所示，第6 天撤除水下平台后，比较各组在目标象限游泳时间。模型组较正常组在目标象限游泳时间明显减少(P ＜0.05);两电针组较模型组在目标象限游泳时间明显延长(P ＜0.05)，两电针组比较无统计学差异(P ＞0.05)。

表2 各组小鼠Morris 水迷宫实验目标象限游泳时间比较(±s，单位:s)

表2 各组小鼠Morris 水迷宫实验目标象限游泳时间比较(±s，单位:s)

注:与正常组比较，#P ＜0.05;与模型组比较，* P ＜0.05。

组别 例数 目标象限游泳时间正常组823.67 ±5.78模型组 8 12.09 ±6.97#脉冲电针组 8 29.18 ±10.68*音乐电针组 8 26.50 ±4.93*

3.2 不同电针对SAMP8 小鼠大脑皮层APP、ApoE mRNA 表达的影响

如表3 所示，与正常组比较，模型组小鼠大脑皮层APP mRNA、ApoE mRNA 表达水平均明显提高(P ＜0.05);与模型组比较，脉冲电针组、音乐电针组APPmRNA 表达水平明显下调(P ＜0.05)，ApoE mRNA表达水平有下调趋势，但无统计学差异。

表3 各组小鼠APP、ApoEmRNA 表达比较(±s)

表3 各组小鼠APP、ApoEmRNA 表达比较(±s)

注:与正常组比较，#P ＜0.05;与模型组比较，* P ＜0.05。

组别 例数APP mRNA ApoE mRNA正常组8 1.02 ±0.24 1.01 ±0.14模型组 8 4.97 ±0.79 # 3.89 ±0.32#脉冲电针组 8 2.25 ±0.52* 3.03 ±0.50音乐电针组 8 2.38 ±0.50*2.56 ±0.63

4 讨论

大量家族史及双胞胎的研究均表明遗传因素在AD 的发病中具有极其重要的作用。APP 基因是第1个被发现与AD 有关的基因，国外早期采用原位分子杂交法证明其在AD 的脑组织中存在过度表达。另外，由该基因16、17 外显子编码的蛋白质异构体APP经β-分泌酶和γ-分泌酶水解产生的Aβ 可诱发神经元变性［9］。研究显示，APP 可能具有受体功能，如果APP 过高表达或APP 突变体表达均可引起细胞内α-APP 和β-APP 等片段水平升高，它们可扰乱信号转导，引发细胞凋亡［10］。ApoE 基因主要与晚发型AD相关。动物实验表明，ApoE 大量存在于AD 模型小鼠脑内的老年斑和神经元纤维缠结中，并且能够使脑组织中过度磷酸化的tau 蛋白含量增加［11］。ApoE 影响APP 的β 折叠，促进Aβ 构型改变，使可溶性Aβ 变成具有神经毒性的不可容性的Aβ 多聚物。因此，下调APP、ApoE mRNA，抑制APP 及ApoE 在脑内过度表达，可一定程度改善AD。

本实验结果显示，脉冲电针和音乐电针均可改善AD 模型小鼠学习记忆障碍，但音乐电针对改善学习记忆的获取能力优于脉冲电针，而对于维持空间位置记忆两者相当;在调控基因表达方面，两种电针均可下调APP mRNA 表达，音乐电针不亚于脉冲电针，但对ApoE mRNA 无显著作用，原因可能是ApoE 基因具有多态性，有ApoE2、ApoE3、ApoE4 3 个不同等位基因，因此还不能否认电针对ApoE mRNA 表达无调控作用，有待于对不同基因型进一步研究。电针抗痴呆作用途径复杂多样，通过抑制APP mRNA 表达，减少APP 水解产生Aβ 可能是电针抗痴呆的作用途径之一。音乐电针作用与脉冲电针相比略胜一筹，但无显著性差异，考虑将模型动物换成灵长类等智力较高的动物，可能作用更加显著。

［1］ Schonrock N，Gotz J.Decoding the non-coding RNAs in Alzheimer's disease［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69(21):3543-3559

［2］ Vitek MP，Christensen DJ，Wilcock D，et al.APOE-mimetic peptides reduce behavioral deficits，plaques and tangles in Alzheimer's disease transgenics［J］.Neurodegener Dis，2012，10(1-4):122-126

［3］ 王威，唐伟，孙忠人.电针对拟老年性痴呆大鼠学习记忆功能和海马CA1 区突触可塑性的影响［J］. 中国老年学杂志，2011(11):2045-2048

［4］ 余曙光，罗松，韩婷，等.电针对老年性痴呆大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响研究［J］.中华神经医学杂志，2006(4):369-371

［5］ 张晓琳，郭慧，刘娟，等. 电针对老年性痴呆大鼠行为学及CAT、MDA 影响的实验研究［J］.针灸临床杂志，2011(2):59-62

［6］ 张露芬.实验针灸学［M］.北京:化学工业出版社，2010:210-220

［7］ Hval ES，Barrett SF，Wilcox M，et al.An improved Morris Water Maze tracking algorithm for psychophysical studies［J］. Ann Biomed Eng，2004，32(8):1141-1152

［8］ Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method［J］.Nat Protoc，2008，3(6):1101-1108

［9］ Ting JT，Kelley BG，Lambert TJ，et al.Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(1):353-358

［10］ Rovelet-Lecrux A，Hannequin D，Raux G，et al. APP locus duplication causes autosomal dominant early- onset Alzheimer disease with cerebral amyloid angiopathy［J］. Nat Genet，2006，38(1):24-26

［11］ Harris FM，Brecht WJ，Xu Q，et al. Increased tau phosphorylation in apolipoprotein E4 transgenic mice is associated with activation of extracellular signal-regulated kinase:modulation by zinc［J］.J Biol Chem，2004，279(43):44795-44801