周婧 管怀进

年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)是最常见的致盲性眼病[1-2]，其病因和发病机制迄今仍不清楚。公认的危险因素除了紫外线照射等外源性因素外，衰老、心血管疾病等内源性代谢产生的自由基和活性氧也会引起氧化损伤，致使晶状体的DNA、脂质和蛋白质产生过氧化作用，最终导致晶状体混浊。而谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S transferase，GST)被认为是保护晶状体免受氧化损伤的重要酶。GST主要通过催化还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)与毒性化合物结合而清除自由基，抑制晶状体发生氧化损伤从而抑制白内障。然而，不同个体的清除能力存在明显差异，造成这种差异的遗传物质基础很大程度上来源于基因多态性。本研究利用实时荧光定量PCR技术检测ARC患者GSTM1、GSTT1基因拷贝数多态性，以探讨GSTM1、GSTT1基因拷贝数变异是否与ARC有关。

1 资料与方法

1.1研究对象2008年6月至8月间，从“江苏眼病研究”南通流行病学调查基地[3]收集ARC组患者279例(558眼)，年龄(69.0±8.4)岁；对照组145例(290眼)，年龄(64.5±4.2)岁；男175例，女249例，均为汉族人(所有人四代内均为中国汉族人)。ARC组包括131例皮质性白内障、70例核性白内障、78例后囊下性白内障患者。本研究遵循赫尔辛基宣言，获得南通大学附属医院伦理委员会批准(批号为2010-05)，检查前所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.1ARC组纳入与排除标准晶状体混浊标准参照文献[4]，包括空泡、水裂、板层分离、轮幅状混浊、楔形混浊、核混浊及后囊膜下混浊等，不包括少数对视力无影响的点状混浊；最佳矫正视力<0.7；年龄≥60岁。排除糖尿病、外伤、近视、青光眼、视网膜脱离及其他原因引起的并发性白内障，排除双眼中任一眼为人工晶状体眼或无晶状体眼，排除明显全身性疾病，排除自由基相关疾病如糖尿病、心血管疾病、肾脏病和癌症等。

1.1.2对照组纳入与排除标准晶状体透明，双眼最佳矫正视力>0.8，年龄≥60岁，与ARC组无亲属关系，均无ARC家族史，与ARC组年龄、性别相匹配。排除青光眼、葡萄膜炎等眼病，排除全身性疾病及自由基氧化损伤相关疾病。

1.1.3观察项目上午700～1000我们对所有受检者进行问卷调查，排除全身性氧化损伤相关疾病史；并对受检者血压、肝肾功能、血糖、电解质进行检测，排除肾脏疾病和血糖水平异常的情况(空腹血糖>6.05 mmol·L-1)。对所有ARC患者和对照组人群进行全面的眼部检查，包括视力检查，散瞳后用裂隙灯显微镜和直接检眼镜进行眼附属器、角膜、前房、晶状体、玻璃体及视网膜等的检查(浅前房者不进行散瞳检查)。使用LOCSⅡ分级系统对晶状体混浊状态进行分级。

1.2主要试剂及仪器DNA血提取试剂盒(德国Qiagen公司)，TaqMan探针和引物、FAM-标记基因分析试剂盒、VIC-标记基因分析试剂盒、人类基因组DNA对照(美国ABI 公司)。裂隙灯显微镜、Y26H检眼镜(苏州六六医疗器械股份有限公司)，电热恒温水温箱(上海联进医疗器械厂)，超净工作台(苏州苏进集团)，低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，紫外分光光度计(美国GE 公司)，7500实时荧光定量PCR 仪、7500型实时PCR系统软件(美国ABI公司)。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的提取抽取ARC组和对照组外周静脉血2 mL，按Qiagen方法(按照使用说明)提取DNA洗脱至200 μL，-20 ℃储存。

1.3.2DNA浓度测定DNA提取后，通过紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度。OD260/OD280比值用于评估DNA的纯度，理想的OD260/OD280比值为1.7～2.0。所测的样本DNA浓度为60～120 ng·mL-1，OD260/OD280为1.6～2.0，符合试验要求。

1.3.3引物、TaqMan探针合成购买试验所用的GSTM1、GSTT1基因拷贝数检测的TaqMan探针(FAM标记)和引物[4]，以RNase P为内参照(RNase P在基因组中的拷贝数恒定为2，探针为VIC标记)。引物和探针序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR目的基因扩增的探针和引物序列

1.3.4实时荧光定量PCR反应体外扩增目的基因，反应体系为25 μL，包括2×TaqMan PCR混合液12.5 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，10 μmol·L-1TaqMan探针1 μL，100 mg·L-1DNA 0.2 μL，余下的用去离子水补足。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃45 s，40个循环。反应设立内对照RNase P基因。每个样本进行目的基因扩增时均重复3次，反应在7500型实时荧光定量PCR仪上进行。

1.3.5目的基因相对拷贝数计算应用△△Ct法，与内对照RNase P基因比较可以得出GSTM1、GSTT1基因的相对拷贝数(Ct值)，△Ct是代表每个样本3次重复的平均Ct值，△△Ct=(CtGSTsample-CtRNase Psample)-(CtGSTcalibrator-CtRNase Pcalibrator)，Ct目的基因=2-△△Ct。用CopyCaller软件计算初始反应模板的相对含量，分析GSTM1、GSTT1基因的拷贝数。

1.4统计学分析采用Stata 10.0 统计软件包建立数据库，并用χ2检验进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义，分析ARC组和对照组的相对危险度(relative odds，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)。

2 结果

2.1目的基因和内参基因扩增效率及目的基因不同拷贝数的实时荧光分析图各样本DNA的GSTM1、GSTT1基因和RNase P基因3次PCR扩增曲线基本重合、扩增效率基本一致，Ct值基本相同(图1)。所有样本目的基因Ct值>39定义为0个拷贝，RNase P基因Ct值>27定义为0个拷贝。CopyCaller软件计算结果显示：拷贝数为0、1、2和>2的GSTM1基因与RNase P基因Ct值的差值平均值分别为0.142 17、-0.134 58、-0.986 76和-1.691 63。拷贝数为0、1、2和>2的GSTT1基因与RNase P基因Ct值的差值平均值分别为0.001 79、0.125 17、-0.780 88和-1.440 14。

Figure 1 Amplification curve of GSTM1 and RNaseP gene.Three PCR amplification curves of GSTM1 and RNase P gene were basically coincidence,and Ct values were basically same GSTM1基因和RNase P基因的扩增曲线图。GSTM1基因和 RNase P基因3次PCR扩增曲线基本重合，Ct值基本相同

2.2实时荧光定量PCR检测的GSTM1、GSTT1基因拷贝数分布情况

2.2.1ARC组和对照组GSTM1、GSTT1基因拷贝数的分布情况ARC组GSTM1基因拷贝数为0、1、2和>2的患者分别为171例、67例、28例和13例(表2)，对照组GSTM1基因拷贝数为0、1、2和>2的患者分别为95例、28例、14例和8例。ARC组GSTT1基因拷贝数为0、1、2和>2的患者分别为146例、100例、23例和10例，对照组GSTT1基因拷贝数为0、1、2和>2的患者分别为60例、54例、20例和11例。GSTM1基因拷贝数变异的ARC个体与对照组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。GSTT1基因完全缺失(0个拷贝)的ARC个体和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05，OR=1.56，95%CI为1.02-2.38)；至少有1个拷贝缺失GSTT1基因型的个体发生ARC的风险明显增加(P<0.01，OR=2.16，95%CI为1.27-3.67)。

表2 ARC组和对照组GST的基因型分布

2.2.2不同类型的ARC组与对照组GSTT1拷贝数分布比较至少有1个拷贝缺失的GSTT1基因型的患者皮质性ARC发生的风险升高(表3)，OR值为4.81(P<0.001)，而>2个拷贝缺失的GSTT1基因型的患者这种风险降低(OR=0.19，P<0.05)。GSTT1基因完全缺失(0个拷贝)的后囊下性ARC组和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。而GSTT1不同基因型的核性ARC组和对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各类型的ARC组和对照组GSTT1的基因型分布

3 讨论

近年来，随着人类基因组中拷贝数变异的大量发现，遗传变异研究的热点逐渐转移至包含拷贝数变异的结构变异上[5-6]。拷贝数变异是指人类基因组内从1 kb到几个Mb的DNA片段拷贝数的不同，包括DNA片段的插入、删除、复制和复合多位点的变异[6]等类型，其在整个基因组中覆盖的核苷酸总数至少是单核苷酸多态性的3倍，因此，拷贝数变异可能在遗传变异方面起着比单核苷酸多态性更为重要的作用[5]。

以往检测基因拷贝增加或缺失的最常见的方法包括免疫组织化学检测蛋白过表达、荧光原位杂交技术、比较基因组杂交和普通PCR。由于基因分型方法的限制，上述研究只能区别基因的有或无，却无法辨别个体携带的基因多个拷贝量的变化。Marianne等[7]改进了PCR技术，通过内参基因的使用对大样本人群GSTM1、GSTT1基因拷贝数精确定量，此种qRT-PCR技术有效解决了传统定量检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号强度，在2 h内完成对单次PCR扩增反应的384个DNA样本基因型的检测，并记录在电脑中，通过与标准品的目的基因和内参的Ct差值的比较，对起始DNA的拷贝数进行定量，将基因存在的情况深入到基因具体拷贝的数量，从而精确分析基因拷贝数变异与疾病的关系。

本研究使用改进的qRT-PCR技术精确地检测了ARC患者抗氧化损伤基因GSTM1、GSTT1的拷贝数，通过高通量地处理和分析qRT-PCR试验的基因扩增数据，探讨氧化损伤清除基因GSTM1、GSTT1的拷贝数变异与ARC易感性之间的关系。

本研究表明，GSTM1基因拷贝数变异与ARC的易感性无关，而GSTT1基因拷贝数变异与ARC特别是皮质性ARC的易感性有关。上述结果与以前的研究报道不同[8-10]，这可能与以往的研究方法存在缺陷，只能区别基因存在或缺失，却不能辨别一个或多个拷贝的基因型有关，且可能与各人群拷贝数变异的频率不同所导致GST-ARC的易感性差异有关。我们发现：这种改进的qRT-PCR技术能更精确地阐述GSTM1/GSTT1拷贝数变异对ARC的影响，研究显示>2个拷贝GSTT1基因型对皮质性ARC起着保护作用；GSTT1基因拷贝数变异与ARC特别是皮质性白内障有关，但与其他类型的ARC无关。有研究认为在晶状体周边及赤道部分GST活性最高，而在核内GST活性最低[11]，因此我们的研究结果可能与晶状体中GST酶活性的分布不同有关。

不同种族人群中拷贝数变异的数据资料很少。在高加索人中，GSTM1、GSTT1完全缺失的频率分别为44.4%～53.8%和17.9%～29.0%[12-15]，在韩国人中分别为38.2%～58.3%和49.7%～54.3%[16-18]，日本人中分别为51.3%～56.2%和47.5%～54.0%[19-21]。本研究选取的人群来自同一眼病流行病学调查基地，这部分≥60岁的常住汉族人口所处的地理特征相同，克服了流行病学调查中的选择偏倚。

本研究将qRT-PCR技术应用在检测GSTM1、GSTT1基因拷贝数多态性上，国内未见相关报道。该方法简单、快速、结果稳定可靠，能有效克服传统方法所不能区别基因剂量的缺点，适用于流行病学调查中不同人群的基因与眼病易感性的关联研究，值得大力推广。

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