李 颖毛瑞阳杜晓红赵晓薇

1浙江医院干部科 杭州 310013 2温州医科大学附属第一医院

柿叶黄酮对同型半胱氨酸诱导小胶质细胞细胞因子表达的影响

李 颖1毛瑞阳2杜晓红2赵晓薇2

1浙江医院干部科 杭州 310013 2温州医科大学附属第一医院

目的观察柿叶黄酮对同型半胱氨酸诱导的小胶质细胞表达白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响，并与银杏叶提取物EGb761进行比较。方法将体外培养的小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）分成空白对照组、同型半胱氨酸组（Hcy）、Hcy+EGb761组（100mg/L）和Hcy+低、中、高（12.5、25、50μg/mL）剂量柿叶黄酮组，培养72h。应用RT-qPCR方法评价各组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达，酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液中上述细胞因子的蛋白浓度。结果与空白对照组比较，同型半胱氨酸组细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达和细胞培养上清液中蛋白浓度明显增加（P＜0.05）；与同型半胱氨酸组比较，Hcy+EGb761组和Hcy+低、中、高剂量柿叶黄酮组各细胞因子mRNA表达及培养上清液中蛋白浓度均降低（P＜0.05），尤其是高剂量柿叶黄酮组结果与Hcy+EGb761组作用相似。结论柿叶黄酮能抑制同型半胱氨酸诱导小胶质细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α，在一定浓度条件下其作用不亚于银杏叶提取物。

小胶质细胞；柿叶黄酮；同型半胱氨酸；白介素-1β；白介素-6；肿瘤坏死因子-α

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含硫的非必需氨基酸，高同型半胱氨酸血症被认为在认知功能损害、神经元功能退化等多种疾病中起着不可忽视的作用，但机制尚未完全明了[1]。小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统的免疫细胞，在致炎因素作用下被激活为反应性小胶质细胞，后者可分泌多种细胞因子而损害神经元。实验证实Hcy可通过激活NAD（P）H氧化酶产生活性氧簇，使MG活化增殖[2]。因此我们推测Hcy可能通过活化MG分泌多种细胞因子，如白介素-1（interleukin-1，IL-1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）介导神经毒理作用。

柿叶为柿树科柿树属植物柿的新鲜或干燥叶，其中含有黄酮类、三萜类、酚类、香豆素、鞣质、多糖、有机酸等多种化学成分[3]，具有降血糖、降压、抗栓、抗氧化、抗肿瘤、抗突变等作用[4-5]。本实验通过体外细胞培养，观察柿叶的主要成分黄酮对Hcy诱导的MG细胞因子表达的影响，评价其神经保护作用。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）购自中国医学科学院协和医科大学基础医学细胞中心（编号：3111C0001CCC000063）。DL-Hcy购自美国Sigma-Aldrich公司（编号H4628，纯度＞95%）；柿叶黄酮由脑心清片用干浸膏（广州白云山和记黄埔中药有限公司提供）经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量29.7%（HPLC法测得），用2%NaHCO3溶液加热到80℃溶解成含药物5mg/mL的溶液备用；银杏叶提取物（EGb761）购自桂林思特新技术公司天然植物制品厂（批号：ST-1101，其中黄酮≥24%，内酯≥6%）。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，Trizol购自美国Invitrogen生命技术公司，逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，ELISA试剂盒购自美国R&D公司。定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司，酶标仪和洗板机购自美国Thermo科技公司。

1.2细胞培养及分组 将BV-2细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每天换1次培养液，2～3天传代1次，实验时取处于对数生长期细胞，调整BV-2细胞浓度为2×105个/孔，接种于12孔板中，每组设3个复孔。分为空白对照组；Hcy组：Hcy用6‰的冰乙酸配置成0.025mmol/L的母液，每孔加入 2μL母液；Hcy+ EGb761组：再加入100mg/L的EGb761；Hcy+低、中、高剂量柿叶黄酮组：分别加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的柿叶黄酮；各组培养72h后收取细胞样品。

1.3RT-qPCR检测BV-2细胞细胞因子mRNA相对表达量 收集各组细胞，每孔加入500μL Trizol，提取细胞内总RNA，根据Fermentas公司的M-MLV操作说明书进行反转录生成cDNA，用于定量PCR检测目的基因的表达，并以β-Actin作为内参对照。各基因引物序列及扩增长度见表1，定量PCR体系总体积20μL，包括2×SYBR Green Mix 10μL，上、下游引物和模板各1μL及ddH2O 7μL。在定量PCR仪上扩增：95℃预变性2min；95℃15s，59℃20s，72℃20s共40个循环；60～95℃之间检测溶解曲线，每升高0.5℃检测1次，共70个循环。用2-△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

表1 各基因qPCR检测引物信息及扩增长度

1.4ELISA检测BV-2细胞细胞因子蛋白表达量

收集细胞培养上清液，设计酶标板布局，建立标准曲线，严格按照ELISA试剂盒操作要求依次加样、孵育、洗板、加酶标抗体、孵育、洗板、加底物、孵育、终止反应、酶标仪比色等过程，检测BV-2细胞培养上清液中细胞因子蛋白分泌水平。

1.5统计学方法 应用SPSS11.0软件，计量资料用（） 表示，组间计量资料的比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，则采用t检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1柿叶黄酮对细胞因子mRNA表达的影响 RT-qPCR结果显示，Hcy组培养72h后，IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达量均明显高于空白对照组（P＜0.05）；与Hcy组比较，Hcy+EGb761组和Hcy+柿叶黄酮各组上述三种细胞因子的表达量均有减少（P＜0.05），与Hcy+EGb761组比较，Hcy+低剂量柿叶黄酮组TNF-α和Hcy+中、高剂量柿叶黄酮组各因子mRNA表达量与之接近（P＞0.05），见表2。

表2 各组细胞因子mRNA相对表达量比较（）

表2 各组细胞因子mRNA相对表达量比较（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与Hcy组比较，△P＜0.05；与Hcy+ EGb761组比较，#P＜0.05

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2.2柿叶黄酮对细胞因子蛋白表达的影响 与对照组比较，Hcy组培养上清液IL-1β、IL-6和TNF-α浓度明显升高（P＜0.05）；与Hcy组比较，Hcy+EGb761组和Hcy+柿叶黄酮各组三种细胞因子浓度明显降低（P＜0.05），且与Hcy+EGb761组比较，Hcy+中、高剂量柿叶黄酮组IL-1β和IL-6蛋白表达量与之接近，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组细胞因子蛋白表达量比较（） pg/mL

表3 各组细胞因子蛋白表达量比较（） pg/mL

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与Hcy组比较，△P＜0.05；与EGb761组比较，#P＜0.05

组别空白对照组Hcy组Hcy+EGb761组Hcy+低剂量柿叶黄酮组Hcy+中剂量柿叶黄酮组Hcy+高剂量柿叶黄酮组n3 3 3 3 3 3 IL-1β 29.77±2.96 148.19±3.79* 31.73±2.57△84.63±9.12△#53.50±3.89△32.15±3.52△IL-6 46.10±4.34 154.29±1.47* 57.58±6.81△106.03±12.09△#76.90±3.79△72.74±12.91△TNF-α 256.36±1.82 463.73±2.81* 164.78±2.16△351.92±20.49△#291.95±12.21△#266.91±20.34△#

3 讨论

同型半胱氨酸（Hcy）是一种存在于血液和组织中的含硫氨基酸，由甲硫氨酸去甲基化后形成。研究[6-8]表明，Hcy是认知功能障碍的独立危险因素，但具体作用机制尚不完全清楚。小胶质细胞（MG）广泛存在于中枢神经系统，约占脑实质细胞总数的10%～15%，是目前公认的对损伤和疾病进行反应的中枢神经系统效应细胞，其特征之一就是易被任何类型的损伤和疾病活化。诸多研究[9-10]表明，MG通过分泌包括IL-1β、IL-6和TNF-α在内的一系列炎症因子而参与阿尔茨海默病等多种认知功能障碍性疾病的发生发展。本研究结果显示，一定浓度的Hcy可诱导MG表达IL-1β、IL-6和TNF-α，基因和蛋白水平均高于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示Hcy可活化MG并诱导其表达多种细胞因子，而这些细胞因子可能在Hcy对神经系统损伤如认知功能障碍中具有重要意义。无论是在体还是离体实验都证实高浓度的Hcy能显著减少抗氧化剂如还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶的含量，明显升高氧自由基、过氧化氢、丙二醛的含量，且在Hcy浓度升高的情况下对氧化应激敏感的转录因子NF-κB与DNA结合的活性明显增强[11-12]，这些都可能是Hcy诱导MG表达细胞因子的重要原因。

银杏叶提取物EGb761是目前公认的具有抗氧化、清除自由基等作用的药物，研究[13-14]表明，EGb 761可通过抗氧化作用降低NF-κB活性，进而减少Hcy诱导的MCP-1、LOX-1等表达。本研究结果显示，银杏叶提取物EGb761可抑制Hcy诱导MG表达的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α（P＜0.05），与以往的研究结果一致。

脑心清片是用柿叶醋酸乙酯浸出物制成的中药制剂，含有黄酮、有机酸和香豆素类等化学活性成分，临床上用于预防和治疗冠心病、缺血性脑血管病及高血压病等。研究[15-16]发现，脑心清及其有效成分柿叶黄酮可通过上调抗氧化基因bc1-2的表达、清除自由基、抗脂质过氧化改善神经细胞氧化还原状态，调节细胞凋亡从而发挥抗脑缺血损伤和神经保护等作用。此外，柿叶黄酮对实验性糖尿病大鼠及小鼠的血糖均具有显著降低作用，其中通过降低肝脏MDA含量、增强SOD活力等作用，从而增强机体抗氧化能力，清除氧自由基以解除自由基对肝脏和胰岛β-细胞的损伤，促进肝脏功能的恢复和胰岛β-细胞的修复和复生，可能是柿叶降血糖的机制之一[17-18]。本研究发现与银杏叶提取物EGb761类似，一定浓度的柿叶黄酮亦能够抑制Hcy诱导MG表达的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，且高剂量组抑制效果不亚于EGb761，其机制可能与上述抗氧化等神经保护作用有关。

总之，Hcy可以诱导MG分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，柿叶黄酮可抑制这一过程，为中药柿叶黄酮的临床应用提供了新的思路。

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Flavone from Diospyros kaki Leaves Represses the Expression of Cytokines Induced by Homocysteine in Microglia

LI Ying1，MAO Ruiyang2，DU Xiaohong2，ZHAO Xiaowei2. 1 Zhejiang Hospital,Hangzhou（310013）,China; 2 The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

ObjectiveTo evaluate the effect of flavone from diospyros kaki leaves on the expression of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in microgia（BV-2 cells）induced by homocysteine，and compared its effect with that of EGb761.MethodsThe BV-2 cells incubated in vitro were di vided into six groups：blank control group，homocysteine（Hcy）group，EGb761 group（100mg/L）and flavone from diospyros kaki groups of different concentration（12.5，25，50μg/mL）.After 72h incubation，the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α was assessed by RT-qPCR and the protein of cytokines in supernatant was detected by ELISA.ResultsThe mRNA expression and supernatant protein of IL-1β，IL-6，TNF-α in Hcy group were significantly higher than those of control group（P＜0.05），but were significantly decreased in EGb761 group and flavone from diospyros kaki groups compared with those of Hcy group（P＜0.05）.Especially，both the mRNA expression and supernatant protein in higher concentration flavone from diospyros kaki leaf group were comparable to those in EGb761 group.ConclusionFlavone from diospyros kaki leaves can inhibit the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cultured BV-2 cells induced by Hcy.In a certain concentration，it was no less effective than EGb761.

microgia；flavone from diospyros kaki leaves；homocysteine；interleukin-1β；interleukin-6；tumor necrosis factor-α

2013-11-26

修回日期：2014-03-20

浙江省温州市科技计划项目（No.Y20100056）