刘颖慧 周旦阳 寿成珉 牟 新 浙江省中西医结合医院内分泌科 杭州 310003

·论 著·

杭白菊黄酮对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的影响

刘颖慧 周旦阳 寿成珉 牟 新 浙江省中西医结合医院内分泌科 杭州 310003

目的探讨杭白菊黄酮对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响，分析杭白菊黄酮对血管内皮细胞的保护作用。方法HUVEC分正常对照组、高糖组（22mol/L）及低、中、高浓度杭白菊黄酮组（100、200、400mg/mL），作用24～72h后，显微镜观察细胞形态改变，MTT法检测细胞活力。结果不同浓度杭白菊黄酮组细胞存活率均显著高于高糖组（P＜0.05，P＜0.01），尤以400mg/mL高浓度杭白菊黄酮组作用最为显著（P＜0.01）。结论杭白菊黄酮对高糖诱导的HUVEC细胞凋亡有明显的抑制作用，且存在剂量依赖性，对血管内皮具有保护作用。

糖尿病；内皮细胞；杭白菊黄酮；细胞存活率

糖尿病是一种由复合病因引起的以高血糖为特征的代谢综合征，发病机制尚未阐明。目前认为与遗传、环境及自身免疫等因素相关。糖尿病患者心血管并发症的几率是非糖尿病患者的2～4倍，而内皮细胞凋亡是早期血管病变过程中重要的启动环节[1]。

糖尿病血管并发症是患者致残、致死的主要原因。目前已有实验证实血管内皮细胞的损伤是形成糖尿病及其血管并发症的基础，保护血管内皮成为预防并发症的一个关键因素，深入认识高糖在糖尿病血管病变中的作用，成为防治糖尿病血管病变的前提。研究药物对血管内皮的保护作用，对于防治糖尿病血管并发症有着更积极的意义，本实验初步研究了杭白菊黄酮对血管内皮细胞的作用，为杭白菊活性成分的开发应用提供理论基础与参考。

1 实验材料

1.1主要试剂 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自南京凯基生物科技发展有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和0.25%的胰蛋白酶含EGTA消化液购自GIBCO公司；葡萄糖注射液购自杭州市红十字会医院。

1.2药 物 杭白菊水提取物（主要含黄酮）由浙江中医药大学发酵工程实验室提取。

2 实验方法

2.1人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的培养 HUVEC用含10%胎牛血清（FBS）1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2天用含EDTA的胰蛋白酶消化传代取对数生长期细胞用于实验。

2.2分 组 正常对照组：含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的1640培养基；高糖组：加入葡萄糖溶液使其在上述培养液中的终浓度为22mmol/L；低、中、高浓度黄酮组：在高糖组培养液基础上分别加入100、200、400mg/mL浓度的杭白菊水提物。三组作用细胞24、48和72h后显微镜（200×）观察细胞形态。

2.3MTT法检测细胞活力 取对数生长期的HUVEC细胞按0.5×104/mL接种于96孔板内，培养4h后，参照分组方案给药。每24、48、72h，拍照并加MTT20μL/孔，10min后于570nm处，用酶标仪测定OD值，存活率按照公式计算：存活率=给药组OD值/正常值OD值

2.4统计学方法 数据以均数±标准差（） 表示，应用SPSS15.0统计软件，两两比较采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1形态学观察 正常对照组细胞边缘光滑、胞质丰富、胞浆透亮；高糖组细胞数量减少，细胞出现明显的皱缩、空泡等凋亡的典型表现。不同浓度黄硐组细胞数量恢复，细胞形态表现出明显的好转，高浓度黄酮组较正常组细胞数量增多，见图1（插页）。

3.2不同浓度杭白菊黄酮对细胞活力影响 高糖组HUVEC细胞存活率明显低于正常对照组（P＜0.05），且随着诱导时间的延长，存活率逐渐下降。黄酮组细胞存活率较高糖组明显升高，且随着杭白菊黄酮药物浓度升高，各组细胞存活率也随之逐渐升高，尤以400mg/mL浓度黄酮组作用最为显著（P＜0.01），见表1。

4 讨论

早在1997年就有学者提出内皮不仅是屏障，更是一个具有代谢、分泌及免疫功能散布的异质性动力学器官。内皮细胞损伤在心血管疾病的发生发展中起着重要作用，血管内皮细胞凋亡是许多心血管疾病的病理机制[2-3]。高糖可促进内皮细胞凋亡，而细胞凋亡在动脉粥样硬化发生发展中起着重要作用。

在糖尿病血管并发症的病理过程中伴有氧化应激。氧化应激状态是细胞凋亡发生的一个重要媒介[4]。许多凋亡刺激可使细胞内活性氧基团ROS产生或伴有氧化应激。氧自由基直接参与细胞凋亡已在不同种类的细胞中得到证实[5]，高糖环境下，增强的氧化应激反应被视为糖尿病血管并发症的基础。糖尿病患者的机体氧化应激程度增强，抗氧化能力减弱[6]。许多凋亡的抑制剂具有抗氧化活性或加强细胞抗氧化能力。

菊花具有散风清热，平肝明目，清热解毒功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等证[7]。杭白菊是浙江省驰名中外的地道药材，是“浙八味”之一。研究证明[8]，杭白菊中含有多种黄酮类化合物，主要成分有芹菜素、木犀草素、金合欢素、橙皮素、芹菜素-7-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素-7-葡萄糖苷、橙皮苷、棉花皮素五甲醚、5-羟-3′-4′-6，7-四甲氧黄酮等。进一步研究表明，菊花的功效与其所含黄酮类化合物密切相关。而木犀草素（Luteolin）7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素（Apigenin），7-O-β-D-葡萄糖苷为菊花中主要的黄酮类化合物，可在体内水解生成效应成分木犀草素和芹菜素。黄酮类化合物是与人体密切相关的生理活性物质，是许多药用植物的主要活性成分[9]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病和免疫调节等药理作用。杭白菊提取物对血管平滑肌细胞有抑制凋亡、抗氧化作用，且随着杭白菊提取液浓度的不断增加，对血管平滑肌细胞凋亡的抑制作用及抗氧化作用也逐渐增强，呈浓度依赖性[10]。另有研究表明，杭白菊提取液可能在增强TRAIL诱导的大肠癌细胞凋亡作用中起着重要作用[11]。

本研究结果显示，杭白菊黄酮或可通过抑制血

表1 杭白菊黄酮对高糖诱导的HUVEC细胞活力的影响（）

表1 杭白菊黄酮对高糖诱导的HUVEC细胞活力的影响（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，与高糖组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

管内皮细胞凋亡，达到防治糖尿病血管病变的作用，为杭白菊的开发和临床应用提供实验依据。

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Influence of Flavon from Chrysanthemum Morifolium on Apoptosis of HUVECs

LIU Yinghui，ZHOU Danyang，SHOU Chengmin，MOU Xin. Department of Endocrinology，Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou(310003)，China

ObjectiveTo investigate the influence of flavon from Chrysanthemum morifolium on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.MethodsHUVECs were treated with high glucose（22mol/L）and then with flavone from Chrysanthemum morifolium of different concentrations（100，200，and 400mg/mL）for 72h.The cell morphological changes were observed by microscope and cell proliferation was determined by MTT chromatometry.ResultsThe cell viability in flavon groups with different concentrations were higher than that in high glucose group（P＜0.05 or P＜0.01），with the most increase in 400mg/mL flavon group（P＜0.01）.ConclusionFlavonoids from Chrysanthemum morifolium can inhibit the high-glucose-induced apoptosis of HUVECs in a dosedependent manner.This indicated that flavon from Chrysanthemum morifolium have protective effects on HUVECs.

diabetic mellitus；endothelial cells；Chrysanthemum；cell viability

2013-11-20

修回日期：2014-04-10

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2008A136）

刘颖慧，Tel：13116747582