李文仿，欧 琴，张 华，赵宗彬，王 耕

（1.湖北医药学院附属太和医院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北医药学院基础医学院微生物学教研室，湖北十堰442000）

木犀草素抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4通路的作用

李文仿1，欧 琴2，张 华1，赵宗彬1，王 耕1

（1.湖北医药学院附属太和医院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北医药学院基础医学院微生物学教研室，湖北十堰442000）

目的探讨木犀草素对乳腺癌细胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4信号通路抑制作用。方法采用不同浓度的木犀草素处理乳腺癌细胞MDA-MB-231，观察乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞增殖、趋化运动及CXCR4蛋白表达。结果木犀草素明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖，明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 CXCR4蛋白表达，并明显抑制SDF-1α/CXCR4对乳腺癌细胞MDA-MB-231的激活。结论木犀草素可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及SDF-1α/CXCR4介导的乳腺癌细胞的信号激活作用，在预防乳腺癌复发及转移中可能有重要的作用。

木犀草素；乳腺癌；CXCR4

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率正在逐年升高，而且日趋年轻化，给患者生活带来严重不良影响。最近研究［1］发现木犀草素是一种在各种蔬菜及水果中广泛分布的天然黄酮化合物，具有抗肿瘤作用，可以通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡机制抑制甲状腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长，在体外对人肝癌细胞（HepG2、J5）等10多种肿瘤细胞有抑制增殖作用，具有很好的抗肿瘤前景。

CXCR4与其特异性配体在乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌等多种肿瘤趋化转移中发挥重要作用，抑制多种肿瘤细胞侵袭，转移。乳腺癌细胞较正常乳腺细胞的CXCR4表达明显增高，而在乳腺癌高转移的靶器官肝、骨髓及肺中高表达其配体基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α），推测SDF-1α/ CXCR4介导了乳腺癌细胞靶向转移［2］。拮抗乳腺癌细胞中CXCR4功能在减少乳腺癌细胞转移中发挥重要作用［3］，提示CXCR12/CXCR4能介导肿瘤细胞向特异性的部位“归巢”，即诱导肿瘤细胞器官特异性的转移。乳腺癌细胞MDA-MB-231存在高表达CXCR4，并且后者与MDA-MB-231细胞恶性程度及高转移、复发、侵袭密切相关。本研究探讨木犀草素对MDA-MB-231的增殖及SDF-1α/CXCR4信号通路激活抑制作用，并观察其作为乳腺癌侵袭转移抑制治疗辅助措施的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院细胞库上海保藏中心，细胞在含体积分数10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 g·mL-1链霉素的DFMN培养基中，于37℃，体积分数5%CO2的条件下培养，每3～4 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验，CXCR4单克隆抗体购自美国Abcam公司，p-AKT、GADPH及PI3K单克隆抗体购自美国Cell Signal公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞计数实验 用DFMN培养基调整乳腺癌细胞MDA-MB-231浓度为1.5×105 mL-1，将2 mL调整浓度后的细胞均匀贴壁在6孔培养皿，3 h后，乳腺癌细胞MDA-MB-231完全贴壁，将培养皿的培养基换为含浓度为0、6、12 μg·mL-1木犀草素的培养基，每种浓度设3个重复孔并取其均值，分别于培养后24 h、48 h、72 h计数乳腺癌细胞MDA-MB-231。

1.2.2 细胞趋化实验 选择直径为8 μm的Trans well趋化小室，基底用胶原蛋白包被30 min后将Trans well趋化小室倒置，将100 μL调整细胞浓度后的培养基置于趋化小室基底，贴壁4 h后轻轻吸去培养基，将趋化小室倒置在含木犀草素0、6、12 μg·mL-1的500 μL培养基的下室培养12 h，然后将趋化小室上室培养基换为含100 ng·mL-1的SDF-1α的培养液，乳腺癌细胞MDA-MB231趋化运动4 h后，棉签轻轻刮去没有发生趋化运动的细胞，将小室基底以含质量分数2%甲苯胺蓝的40 g·L-1低聚甲醛染色1 h，显微镜下随机计数10个视野的已经发生趋化运动的细胞。

1.2.3 Western Blot实验 将乳腺癌细胞MDA-MB-231分别用12 μg·mL-1的木犀草素处理24 h、48 h，然后提取蛋白，取100 μg等量蛋白做Western Blot实验，在体积分数10%分离胶上等蛋白条带分离清晰，以硝酸纤维薄膜转膜，PBS清洗，体积分数5%脱脂奶粉封闭1 h，然后分别加入浓度为1∶1 000的CXCR4（或PI3K）一抗，4℃过夜，PBS洗涤3次，每次10 min，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗1 h，PBS洗涤3次，每次10 min，然后加入显色剂，X光机读片。

1.2.4 木犀草素对乳腺癌细胞MDA-MB-231 SDF-1α信号激活抑制作用研究乳腺癌细胞MDA-MB-231用12 μg·mL-1的木犀草素培养基分别处理0 h、24 h和48 h，然后，观察含100 ng·mL-1SDF-1α培养基处理乳腺癌细胞MDA-MB-231 10 min后对AKT激活作用。取含磷酸化酶抑制剂的RIPA液裂解细胞，并将100 μg蛋白进行Western Blot试验，在体积分数10%分离胶上等蛋白条带分离清晰，以硝酸纤维薄膜转膜，PBS清洗，体积分数5%胎牛血清封闭1 h，然后分别加入浓度为1：1 000的p-AKT的一抗4℃过夜，PBS洗涤3次，每次10 min，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗1 h，PBS洗涤3次，每次10 min后加入显色剂，X光机读片。

2 结果

2.1 木犀草素抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖结果细胞计数实验表明，木犀草素可显著抑制乳腺癌细胞增殖，6、12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h及72 h均可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素较6 μg·mL-1木犀草素抑制细胞增殖能力更强。见表1。

表1 木犀草素抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的结果

2.2 木犀草素抑制SDF-1α/CXCR4介导的乳腺癌细胞MDA-MB-231趋化运动及CXCR4表达乳腺癌细胞MDA-MB-231中具有高表达CXCR4的临床特点，而且高表达CXCR4与乳腺癌细胞趋化转移密切相关，本趋化实验发现木犀草素处理12 h后，乳腺癌细胞MDA-MB-231趋化活性完全被抑制，12 μg·mL-1木犀草素几乎完全抑制了乳腺癌细胞MDA-MB-231的趋化运动（表2）。Western Blot检测CXCR4蛋白表达变化，发现12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h可显著抑制CXCR4蛋白表达（图1）。

表2 木犀草素对SDF-1α/CXCR4介导的乳腺癌细胞MDA-MB-231趋化抑制作用

图1 Western Blot检测CXCR4蛋白表达

2.3 木犀草素抑制 SDF-1α对乳腺癌细胞 MDAMB-231的信号激活本实验表明，乳腺癌细胞MDAMB-231经含SDF-1α浓度为100 ng·mL-1培养基作用10m in后，可明显激活乳腺癌细胞MDA-MB-231 AKT信号通路，但是经12 μg·mL-1木犀草素处理24 h、48 h后，AKT信号通路可明显被抑制。PI3K激酶在AKT激活中发挥重要作用，木犀草素可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中PI3K的表达。见图2。

图2 木犀草素对SDF-1α对乳腺癌细胞MDA-MB-231的信号激活的抑制图像

3 讨论

目前，乳腺癌的治疗包括传统的乳腺癌改良根治术，乳腺癌被认为是全身性疾病，即使是早期乳腺癌，诊断时也有早期血液转移，因此，主张手术后行规范的化疗，但化疗药物一般均有毒副反应重、对肿瘤细胞选择性差，尤其对机体免疫系统的破坏可导致肿瘤复发，最终导致患者死亡。最近研究［4-6］报道日常膳食中的黄酮化合物木犀草素有促进乳腺癌细胞MCF-7、MDAMB-231凋亡作用，抑制FGF对AKT及FRK的激活，可增加乳腺癌细胞Bax表达，下调Bcl-xl表达，同时抑制FGF介导的MAPP信号通路的激活。乳腺癌细胞MDA-MB-231具有FR、PR受体阴性，Her2也表达阴性，高度侵袭、转移的特征，临床治疗化疗不敏感，容易出现远处转移及复发，严重威胁患者生命健康。本组结果表明，木犀草素可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素抑制癌细胞增殖作用更为明显，提示木犀草素具有抗乳腺癌潜能。

CXCL12也称为SDF-1α，生理情况下广泛分布于免疫器官、脑、心、肝、肾和肺等组织。CXCR4是7次穿膜的G蛋白偶联受体，与SDF-1α相互作用，构成的SDF-1α/CXCR4生物学轴介导细胞迁移，与多种恶性肿瘤侵袭转移密切相关。Müller等［2］在2001年首次研究了趋化因子在转移性乳腺癌中的功能，发现乳腺癌常转移至骨髓、肺和肝脏等高表达CXCL12的部位，而很少转移到肾脏、皮肤、肌肉等低表达CXCL12的部位。CXCR4特异性抑制剂可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231肺转移［7］。CXCR4表达水平与乳腺癌腋窝淋巴结和远处转移存在明显相关，CXCR4的高表达与肿瘤细胞的恶性程度及预后相关［8］。本研究结果表明，木犀草素可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中CXCR4蛋白表达，抑制SDF-1α/CXCR4介导的乳腺癌趋化运动。

本研究也发现SDF-1α可明显激活AKT，从而促使乳腺癌细胞MDA-MB-231发生增殖、转移，但木犀草素明显抑制了乳腺癌中AKT的激活。因此，我们的研究表明，木犀草素抑制了乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖，而且抑制了SDF-1α/CXCR4介导的乳腺癌细胞MDA-MB-231趋化运动，明显抑制CXCR4蛋白表达，抑制SDF-1α/CXCR4介导的AKT激活，表明木犀草素是潜在的重要的天然抗肿瘤物质。

参考文献：

［1］ Sadzuka Y，Sugiyama T，Shimoi K，et al.Protective effect of flavonoids on doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］.Toxicol Lett，1997，92（1）：1-7.

［2］ Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410（6824）：50 -56.

［3］ Park BH，Kook S，Lee S，et al.An isoform of C/FBPβ，LIP，regulates expression of the chemokine receptor CXCR4 and modulates breast cancer cell migration［J］.J Biol Chem，2013，288（40）：28656-28667.

［4］ Jeon YW，Suh YJ.Synergistic apoptotic effect of celecoxib and luteolin on breast cancer cells［J］.Oncol Rep，2013，29（2）：819 -825.

［5］ Lee FJ，Oh SY，Sung MK.Luteolin exerts anti-tumor activity through the suppression of epidermal growth factor receptor-mediated pathway in MDA-MB-231 FR-negative breast cancer cells［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（11）：4136-4143.

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［7］ Shepard JB，Wilkinson RA，Starkey JR，et al.Novel guanide-substituted compounds bind to CXCR4 and inhibit breast cancer metastasis［J］.Anticancer Drugs，2014，25（1）：8-16.

［8］ Xu TP，Shen H，Liu LX，et al.The impact of chemokine receptor CXCR4 on breast cancer prognosis：a meta-analysis［J］.Cancer Fpidemiol，2013，37（5）：725-731.

Inhibition Effect of Luteolin on SDF-1α/CXCR4 Signal Pathway in Breast Cancer Cells MDA-MB-231

Li Wenfang1，Ou Qin2，Zhang Hua1，Zhao Zongbing1，Wang Geng1
（1.Department of General Surgery，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；2.Department of Microbiology，School of Basic Medical Science，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

ObjectiveTo study the inhibition Fffect of luteolin on SDF-1α/CXCR4 signal pathway in breast cancer cells MDA-MB-231.MethodsDifferent concentrations of luteolin were used to treat breast cancer cells MDA-MB-231，the cell enhancement，chemotactic migration and expression of CXCR4 were observed in breast cancer cells MDA-MB-231.ResultsLuteolin inhibited significantly the cell proliferation，the expression of CXCR4 and SDF-1α/CXCR4 activation in the breast cancer cells of breast cancer cells MDA-MB-231.ConclusionLuteolin can inhibit the cell proliferation and SDF-1α/CXCR4 signal activation of breast cancer cells MDA-MB-231，and may be important in the prevention of recurrence and metastasis of breast cancer.

luteolin；breast cancer；CXCR4

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412（2014）03-0199-04

2013-10-13）

李文仿（1979-），男，博士，主治医师，主要从事乳腺外科方面的研究。F-mail：2671422764@qq.com

王耕（1966-），男，主任医师，主要从事乳腺外科方面的研究。