洪卫文，苏国强，应红安，林峰，梁卫东

（1.台州市第一人民医院 普外科，浙江 台州 318020；2.厦门大学附属第一医院 普外科，福建厦门 361000；3.台州市第一人民医院 特需VIP病区，浙江 台州 318020）

黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）与肿瘤侵袭转移的高度相关性已在一些研究中得到证实[1-2]。FAK在原发性大肠癌、肝癌组织中高表达可能促进肿瘤侵袭转移，并有研究证实沉默FAK表达可以抑制乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞的增殖及转移[3-5]。FAK沉默有望成为结直肠癌治疗的新方法，而目前国内有关稳定沉默FAK的结肠癌细胞模型鲜有报道。本研究应用已构建的FAK RNA干扰（RNA interference，RNAi)慢病毒载体，通过包装293T细胞产生重组病毒，感染SW620结肠癌细胞，并使用新霉素G418筛选稳定感染病毒的细胞株，以建立稳定FAK沉默的结肠癌细胞株SW620模型。此方法将为进一步研究沉默FAK基因表达对人转移大肠癌细胞的侵袭和转移的裸鼠体内实验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒表达载体pLentilox3.7、293T细胞、大肠杆菌DH5α均由厦门大学李博安教授惠赠。慢病毒包装系统由pLentilox3.7、PHR、VSVG质粒组成。

1.2 主要的仪器和试剂 CO2培养箱（美国Thermo Forma），倒置显微镜、倒置荧光显微镜、照相显微镜（日本Olympus），培养板（美国Costar），等。试剂：质粒小抽提取试剂盒（美国Qiangen），DMEM培养基、1640培养基、新生小牛血清、DMEM、G418、NEAA、RMPI 1640（美国Gibco），氨苄青霉素、TEMED（美国Sigma），TurboFect（美国Fermentas），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美国Millipore），24孔板、细胞计数板（美国Costar），Tris（美国Boehringer Mannheim），SDS（中国华美生物），羊抗鼠二抗（中国博士德）。

1.3 方法

1.3.1 重组RNAi质粒的扩增与提取：向DH5α感受态细菌100μL中加入构建好的重组RNAi质粒，冰浴30 min；42 ℃水浴锅中热休克90 s，冰浴2 min，然后铺于含氨苄霉素（30μg/mL）的琼脂平板表面，挑单个菌落，孵育12～16 h，按照试剂盒操作说明书提取纯化质粒。……