唐晓旭 丁忠家 王人凤 施泽涛 邢蔚 闫辉 武瑾 宋勇莉 卢连军

锰是人体必需的微量元素之一，涉及人体多种生化功能和代谢过程，长期摄入过量锰可导致锰中毒，出现帕金森病样临床表现。流行病学调查表明，长期接触锰尘的工人可出现听力下降[1]，但尚不能明确听力下降是因锰中毒引起抑或环境噪声引起。Ding等[2]通过体外试验，观察氯化锰对耳蜗的影响，发现锰可以导致内、外毛细胞、外周听神经纤维和螺旋神经节细胞的损伤。本研究拟通过观察慢性锰中毒对大鼠耳蜗外毛细胞和螺旋神经节细胞的形态学及听功能的影响，进一步探讨慢性锰中毒致听觉损伤的可能机理。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用雄性断乳21天SD大鼠60只(第四军医大学动物中心提供)为实验动物，体重50～70 g，正常饮食，适应性饲养3天后，随机分为染毒组和正常对照组，每组30只。各组大鼠分笼饲养，所有动物饲以普通饲料，自由饮水和进食，笼具、饮水瓶等所有用具均为非含锰制品。实验过程中，动物饲养环境温度、湿度、光照强度均符合实验动物规范。

1.2实验的主要试剂和仪器 氯化锰溶液(MnCl2·4H2O)、鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)均购自美国Sigma公司，听觉脑干监测仪(型号RZ6，购自美国TDT公司)，一次性真空采血管(购自西安壮志生物公司)。

1.3氯化锰给药及血锰浓度检测方法 染毒组大鼠每日以氯化锰水溶液(MnCl2·4H2O)100 mg·kg-1d-1经口灌胃[3]，正常对照组大鼠以等量去离子水灌胃，灌胃液体容量：动物体重小于0.1 kg时为0.5 ml，大于0.1 kg时为1.0 ml；每天一次，连续灌胃12 w。两组大鼠实验期间均自由饮用去离子水，分别于灌胃4 、8 和12 w后抽取大鼠尾血进行血锰浓度检测(西安地矿中心检测)。

1.4听性脑干反应(ABR)检测 灌胃12 w后两组大鼠分别进行ABR检测，测试在屏蔽隔声室内完成。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉；1寸毫针作为电极，记录电极置于颅顶正中皮下，参考电极置于测试耳耳后皮下，接地电极刺于鼻尖皮下，刺激声为短纯音(tone burst)，刺激声强度为90 dB SPL由MF1-S立体磁性扬声器输出，耳机距动物外耳道口2 cm，扫描时间10 ms，上升下降时间为0.5 ms，间隔时间为45.517 ms，给声刺激重复率21.97次/秒，滤波带宽100～3 000 Hz，叠加1 024次，以引出波Ⅲ的最小刺激强度为ABR反应阈。

1.5耳蜗细胞形态学观察 完成ABR测试后，分别取两组大鼠耳蜗行基底膜铺片观察、外毛细胞及螺旋神经节细胞计数，透射电镜下观察毛细胞超微结构。

1.5.1基底膜铺片FITC鬼笔环肽染色及观察 各组取大鼠3只，以2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后迅速断头，取双耳听泡，于圆窗和蜗尖处各刺一小孔，以4%多聚甲醛(pH =7.4)自蜗尖向圆窗灌流，并将耳蜗浸泡在相同的固定液中，放入4 ℃ 冰箱后固定过夜；以0.01 M PBS(pH =7.4)漂洗2 次，再置于10% EDTA 液中浸泡3 d 脱钙后，在解剖显微镜下行耳蜗基底膜全层剥离并置于0.3 % TritonX- 100 去污剂浸泡30 min，经0.01 M PBS 漂洗后放入1% 正常牛血清白蛋白封闭 30 min后用FITC-phalloidin(1：60) 避光37 ℃ 孵育30 min，0.01 M PBS 漂洗，铺平、甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.5.2全耳蜗外毛细胞计数 耳蜗基底膜铺片染色后于400 倍的荧光显微镜下，以目镜中实际长度为0.24 mm 的显微测微尺为基本单位，将经FITC-phalloidin 荧光染色的基底膜从蜗顶向蜗底逐个视野依次进行外毛细胞计数，将计数的数据输入到全耳蜗毛细胞定量分析系统中，对于外毛细胞大部分缺失的基底膜，只计数存活细胞数；而外毛细胞大部分存活的基底膜样品中，只计数缺损的外毛细胞数；若外毛细胞全部坏死，则计数为零；若机械损坏导致外毛细胞损伤，则输入Bad，系统可自动按缺失值处理。经软件分析后，毛细胞数量均转换为百分比形式，并生成该耳蜗基底膜的外毛细胞定量分析图谱。

1.5.3螺旋神经节细胞染色及计数 两组各取5只大鼠的耳蜗，将固定的切片经苏木精液染色数分钟后，用稀盐酸乙醇溶液分色，然后浸入1%伊红染液染5～10 min，再经70%乙醇分色，系列乙醇脱水，直至胞质与胞核的红蓝反差鲜明。目镜加网格片，每小格在40×10放大倍数下覆盖面积为10×10 μm，切片厚度4 μm，每隔4张切片记录一张切片的螺旋神经节数，将记录到的螺旋神经节细胞总数取其平均值[4]。

1.5.4透射电镜标本制备及观察 两组各取5只大鼠完成ABR测试后灌注、处死，取左侧耳蜗，在解剖显微镜下去除骨性外壳及血管纹，4%戊二醛固定2 h以上，缓冲液漂洗15 min×2次，1%四氧化锇固定2 h，缓冲液漂洗15 min×2次；梯度丙酮脱水，丙酮+混合包埋液(1：1)包埋，60 ℃孵箱聚合24 h；1 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色，修块、定位，铅、铀各复染10 min，透射电镜 (JEM-1230，日本)观察。

1.6统计学方法 使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,计量资料用重复测量设计资料的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组大鼠血锰浓度比较 两组大鼠灌胃4 、8 及12 w后血锰浓度见表1，可见染毒组三个时间点血锰浓度显著高于对照组(均为P<0.01)，且染毒组血锰浓度随染毒时间延长逐渐增高，其第8 w的血锰浓度明显高于第4 w(P<0.05)，第12 w血锰浓度明显高于第8 w(P<0.05)。

表1 两组大鼠灌胃4、8和12 w后平均血锰浓度比较

注：* 与对照组比较，P<0.01；# 与同组第4 w比较，P<0.05；△ 与同组第8 w比较,P<0.05

2.2灌胃12 w后两组大鼠ABR反应阈比较 两组大鼠灌胃12 w后ABR反应阈见表2。对照组ABR平均反应阈为20.5±2.1 dB SPL，染毒组平均反应阈为46.32±10.6 dB SPL，染毒组各频率ABR反应阈均明显高于对照组(均P<0.05)，其中以高频提高最为显著。

表2 灌胃12 w后两组大鼠各频率ABR反应阈

注：* 与对照组比较，P<0.05

2.3两组大鼠耳蜗外毛细胞形态及缺失率比较 对照组顶、中和底回外毛细胞均排列整齐，纤毛方向一致呈V或W型；染毒组底回外毛细胞出现明显缺失，顶回和中回病变较轻(图1)。对照组和染毒组基底膜外毛细胞的缺失率分别为0.33%和7.33%，染毒组缺失率明显高于对照组(P<0.05) 。

2.4两组大鼠耳蜗螺旋神经节形态及计数比较 对照组螺旋神经节细胞清晰可见，排列整齐；染毒组部分螺旋神经节细胞核型不完整，细胞出现空泡样变(图2)。对照组与染毒组大鼠平均螺旋神经节细胞总数分别为16 873.45±475.76及14 774.38±256.58个，染毒组螺旋神经节细胞较对照组明显减少(P<0.05)。

2.5两组大鼠基底膜毛细胞和螺旋神经节细胞透射电镜观察结果 对照组耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞核圆，核仁明显，细胞质丰富，可见大量的线粒体透光度均匀，形态规则，含有丰富的内质网及高尔基体，细胞器结构清晰，线粒体嵴致密清楚；而染毒组毛细胞和螺旋神经节细胞核型稍不规则，核膜周边有少量异染色质聚集，部分线粒体嵴消失或断裂，呈空泡样改变，螺旋神经节细胞线粒体尚可见髓样改变(图3、4)。

3 讨论

锰是人体必需的微量元素，摄入不足或过度均可导致机体损害。动物锰摄入不足可出现各种各样的结构和功能缺陷，包括生长延迟、骨与软骨畸形、内耳及视神经发育异常[5]。锰中毒常见于采矿、冶炼和从事电焊作业的工人，职业性锰暴露引起中毒的原因可能与锰暴露的持续时间、浓度、频率以及进入体内的途径有关。近年来， 随着锰越来越广泛的使用，其对人类健康的危害也越来越受到重视，成年个体锰中毒早期主要表现为神经毒性，继而出现明显的锥体外系神经受损症状，与帕金森病症状类似[6]；除了神经系统外，慢性锰中毒还可能引起听觉系统的损害。以往文献提示，无论单独的长期锰暴露或同时伴有强噪声暴露，均可出现听力损害[7～9]。

图1 两组大鼠耳蜗底回基底膜铺片 a：对照组，b：染毒组， OHC：外毛细胞，IHC：内毛细胞，红星示外毛细胞缺失(FITC染色)(Scale bar: 20μm)

图3 两组大鼠基底膜毛细胞透射电镜观察结果

a：对照组毛细胞核圆，核仁明显，细胞质丰富，细胞器结构清晰； b：对照组毛细胞线粒体透光度均匀，形态规则，可见丰富的内质网及高尔基体，线粒体嵴致密清楚；c：染毒组毛细胞核型稍不规则，核膜周边有少量异染色质聚集；d：染毒组毛细胞线粒体肿胀，嵴减少或消失，黑色箭头示空泡样变

图4 两组大鼠螺旋神经节细胞透射电镜观察结果

a：对照组螺旋神经节细胞核圆，核仁明显，细胞胞质丰富，细胞器结构清晰；b：对照组螺旋神经节细胞线粒体透光度均匀，形态规则，线粒体嵴致密清楚；c：染毒组螺旋神经节细胞核型稍不规则，核膜周边有少量异染色质聚集；d：染毒组螺旋神经节细胞线粒体肿胀、嵴消失或断裂，空泡样改变，黑色箭头示髓样结构

本研究结果显示染毒组动物的血锰浓度随染毒时间延长而逐渐增高，在灌胃12 w后，其ABR平均反应阈明显高于正常对照组，尤以高频区改变最明显，证明慢性锰中毒可以导致大鼠听损伤。从文中结果看，慢性锰中毒可导致大鼠的耳蜗外毛细胞缺失，其中以耳蜗底回外毛细胞缺失最为明显，提示了大鼠慢性锰中毒主要出现高频听力损失的原因。

研究表明，锰的神经毒性与多巴胺耗竭、自由基的产生、线粒体损伤和钙稳态失衡等因素有关[10]，但目前尚不清楚慢性锰中毒导致听损伤的确切机制。Me等[11]通过全身给予小鼠氯化锰后，发现氯化锰在内耳聚集，提示锰暴露后，吸收至体内的锰可以进入内耳，并进一步证实小鼠内耳血管内皮细胞中金属转运体的存在，血液中的锰离子可以被金属转运体转运至内耳；在新生大鼠耳蜗器官培养条件下，氯化锰可以导致感觉毛细胞、外周听觉神经纤维和螺旋神经节细胞明显损害，证实锰具有耳毒性[12]。研究显示[2]锰的浓度在微摩尔水平即可表现出耳毒性，且损害程度呈剂量依赖性，螺旋神经节细胞较感觉毛细胞敏感，耳蜗底回的外毛细胞较顶回的敏感。线粒体是细胞能量代谢的场所，锰对线粒体具有特殊的亲和力，锰中毒后锰离子聚集最多的亚细胞器就是线粒体，目前认为线粒体形态的改变是锰诱导细胞损伤的早期表现[12～14]。Malecki等[15]在研究锰对大鼠原代纹状神经元的影响中，发现锰毒性与线粒体功能失调、自由基产生及DNA断裂有关，提示锰中毒可以诱导凋亡性细胞死亡。Tamm[16]采用鼠源性神经干细胞系和大鼠胚胎原代神经干细胞研究锰对神经发育的影响，发现神经干细胞对锰高度敏感，并可通过激活线粒体caspase介导的通路，诱导干细胞发生凋亡，同时还证实氧化应激在锰诱导神经干细胞死亡中发挥至关重要的作用。从本研究透射电镜观察结果可见，慢性锰中毒可导致耳蜗外毛细胞和螺旋神经元线粒体形态发生改变，包括线粒体嵴消失或断裂、空泡样变，可能与螺旋神经节细胞凋亡有关。

综上所述，慢性锰中毒通过损伤耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞引起大鼠听力下降。由于本研究采用的染毒剂量和中毒时间比较单一，因此研究结果很可能具有局限性。对于慢性锰中毒对听力影响的染毒剂量、染毒时间与效应的关系以及慢性锰中毒损害听力的发病机制等，还有待于今后更深入的研究。

4 参考文献

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