付丹丹

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000）

高原肺动脉高压大鼠重返平原后肺组织中5-HTT基因表达变化

付丹丹

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000）

目的探讨高原肺动脉高压大鼠重返平原后肺组织中5-羟色胺转运体基因表达变化。方法46只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（C组，8只），高原低压低氧组（H组，8只），重返平原组（R10组，R20组，R30组,每组10只），正常对照组大鼠置于平原常压常氧处喂养，高原低压低氧组和重返平原组置于模拟海拔5000米高原环境喂养建立肺动脉高压动物模型，重返平原组大鼠建立肺动脉高压动物模型后再于平原饲养，应用RT-PCR方法检测各组大鼠肺组织中5-羟色胺转运体基因表达水平。结果与正常对照组（0.11±0.03）相比较，5-羟色胺转运体mRNA在高原低压低氧组表达明显增高(0.92±0.03，P＜0.01)，重返平原组10 d，20 d组表达增高（0.57±0.02，0.38± 0.02，P＜0.01），随重返平原时间的延长其表达量不断下降，R30组表达无差异（0.14±0.04，P＞0.05）。结论5-羟色胺转运体基因在高原低压低氧环境中表达量明显增高，重返平原后，5-羟色胺转运体基因表达降低并逐渐恢复。

高原；肺动脉高压；5-羟色胺转运体；重返平原

高原肺动脉高压（High altitude pulmonary hypertension,HAPH）是高原地区的常见病、多发病，同时也是适应生理的重要环节[1]，对高原人群的身体健康构成了严重威胁，关于其具体发病机制目前仍未完全阐述，有关学者曾提出：“解决这一问题的唯一办法就是将病人转到低海拔地区”[2]。相关临床及实验研究证明，在一定条件下5-羟色胺（5-HT）可以引起肺血管痉挛、收缩以及结构的重塑，最终会引起肺动脉高压的形成，但发挥这种作用，需要通过5-羟色胺转运体（5-HTT）将5-HT转入细胞内后才能充分发挥。本实验通过观察高原低氧环境中肺动脉高压大鼠重返平原常压常氧以后肺组织中5-HTTmRNA表达变化规律，现将报道如下。

1 材料与方法

清洁级Wistar雄性大鼠46只（购于兰州大学动物实验中心），RT-PCR仪（MJ Research company, USA），凝胶成像分析系统（UVP，GDS8000,USA），TRIzol试剂购于invitrogen公司，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒及2x Taq PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计、合成，低压氧舱（中航工业贵州风雷航空军械公司研制）。

1.2 方法1）动物的分组与处理方法：清洁级Wistar雄性大鼠46只，体重180～220 g,按体重随机分为正常对照组（C组8只）、高原低压低氧组（H组，8只）和重返平原组（R10，R20，R30,各10只）。C组置于平原处喂养30 d，H组和R组饲养于低压氧舱中模拟海拔5000米环境30 d,每天22 h（出舱2 h,打扫清洁喂食），R组再于平原处喂养10 d,20 d和30 d时，各取10只处理。2）标本的取材与处理方法：用20%乌拉坦5 ml/kg腹腔内注射，麻醉大鼠后置于动物手术台上，然后放血处死大鼠，取大鼠左侧下肺叶组织，以蒸馏水快速冲洗肺组织，然后置于液氮中速冻，-80℃冻存备用。3）引物的设计与合成：以大鼠5-HTTmRNA序列为模板，应用Primer Premier 5.0软件设计引物。5-HTT上游引物为：5'-GCTACAACAAGTTCAACAACAAC-3'，下游引物为：5'-GCCACCTCTGACACATCTTC-3'；内参照18S上游引物为：5'-TCACTGAGGATGAGGTGGAACG-3'，下游引物：5'-TCAGTCGCTCCAGGTCTTCACG-3'。5-HTT及18S PCR产物预期片段的长度分别为180和148 bp。4）5-HTT mRNA的检测：精确称取冻存的大鼠肺组织100 mg，按照TRIzol一步抽提法提取细胞总RNA，按照20μL体系逆转录，25μL体系扩增。按照下列条件及方法进行目的基因扩增：预变性94℃3 min,变性94℃30s,退火30s（温度58℃18s，5-HTT 62℃），延伸72℃1min，循环33次。按不同循环数PCR产物的图像分析，证实上述循环参数基本使PCR扩增在指数期内，模板量与循环数经检测均在线性范围内，72℃终末延伸5分钟后终止反应。取PCR产物6 ul，于1.5%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统软件分析处理，以18S作为内参照(见图1）计算5-HTT mRNA的相对表达量。

图1 18S mRNA

1.3 统计学方法采用SPSS11.5软件，对各组实验数据进行处理。本实验为计量资料数据。多组间比较应用方差分析和t检验。

2 结果

RT-PCR扩增结果显示，正常对照组、高原低压低氧组和重返平原组大鼠肺组织中均见5-HTT mRNA表达。C组5-HTT mRNA表达量为0.12± 0.02，H组5-HTT mRNA表达量为0.92±0.03，R10组5-HTT mRNA表达量为0.57±0.02，R20组5-HTT mRNA表达量为0.38±0.02，R30组5-HTT mRNA表达量为0.14±0.04。与正常对照组相比较，高原低压低氧组肺组织中5-HTT mRNA表达明显增高（P＜0.01）。重返平原组于10 d,20 d时，其表达水平则较C组5-HTT mRNA表达量为表达增加（P＜0.01），但30 d时与正常对照组比较其表达水平无明显差异(P＞0.05),重返平原组内比较均有差异（P＜0.01）。见图2。

图2 5-HTT mRNA

3 讨论

在高原上，机体在适应环境的过程中，高原性的肺动脉高压是其中的一个重要环节，同时，其也是一系列的高原性疾病的重要发生基础，例如高原性的红细胞增多症、肺水肿、心脏病等，是一种潜在发生的高原性疾病病程的早期阶段，该疾病有很复杂的发病机制，目前临床上对其仍然没有好的治疗。

5-羟色胺转运体属于一种膜蛋白，它可作为转载体在5-羟色胺内化入细胞时起到重要作用，在血管平滑肌增殖反应中起一定的作用。本实验研究发现，大鼠在模拟的海拔五千米的环境中生活了一个月以后，其肺组织中5-羟色胺转运体信使RNA的表达明显发生上调，这个结果与MacLean等人检测的5-羟色胺转运体表达增加（在低氧的条件下，应用肺血管平滑肌细胞获得）相符合[3]。本实验是在模拟的高原低压、低氧环境下，在大鼠肺组织整体的角度上证实，5-羟色胺转运体的表达是增高的。

曾有相关的资料指出，在平原上曾经生活着的人群当移居到高原上生活时，人群便逐渐的发生了肺动脉性的高压（与高原上的长期的低氧、低压的生活环境密切相关）；当这些人群再返回到了平原之后，由于他们离开了高原的低氧、低压的环境，他们的肺动脉高压逐渐发生改善，有些人群则逐步恢复了正常4]，但这类资料的样本偏低。我们的实验通过研究发现，大鼠在重返平原后，5-羟色胺转运体信使RNA在各个时间段组都有相应的表达，但这些表达在各组间都有明显的差异，随着返回平原的时间的延长，它的表达水平也发生逐步的降低。由此证明，机体由高原转回平原环境生活以后，随时间的增加，会对平原环境慢慢的发生获得性的适应，在大鼠的肺组织中的5-羟色胺转运体信使RNA的表达也会下降，并可逐渐恢复至正常。

[1]Ge Rili,Peter Hackett.Life on the Qinghai-Tibetan plateau[J].Peking University Medical Press,2007,(7):100-110.

[2]Xu XQ,Jing ZC.High-altitude pulmonary hypertension[J].Eur Respir Rev,2009,18(111):13-17.

[3]李雪芹,李运景.肺动脉高压的5-羟色胺/5-羟色胺转运体机制研究进展[J].国际呼吸杂志,2010,30（2）：119-121.

[4]袁慧,魏连忠.超声检测由高原返回内地居住居民的肺动脉改变[J].华西医学,2008,23(4)：823.

R544.16

A

1008-4118（2014）03-0013-02

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.03.05

2014-06-10