高洁，刘弯，曹丹，郜慧英

（1菏泽医学专科学校，山东菏泽274000；2定陶县人民医院重症监护科；3附属菏泽市立医院妇产科）

P53和CD44v6在食管鳞癌中的表达及其临床病理意义

高洁1，刘弯2，曹丹3，郜慧英1

（1菏泽医学专科学校，山东菏泽274000；2定陶县人民医院重症监护科；3附属菏泽市立医院妇产科）

目的探讨P53和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达及与临床病理参数之间的关联性，并分析其与肿瘤浸润转移的关系。方法制作组织芯片并应用免疫组织化学PV-9000二步法检测52例食管鳞状细胞癌组织和18例食管炎症炎组织中P53及CD44v6的表达，采用SPSS19.0统计软件分析各临床病理参数之间的关系，并探讨P53和CD44v6之间的关联性。结果P53和CD44v6在食管鳞癌中的表达高于在食管炎组中的表达（P＜0.05），且在伴有淋巴结转移的鳞癌病例中的阳性率远高于其在无淋巴结转移组中的阳性率（P＜0.05）；P53和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达无明显相关性(r=0.202，P＞0.05)。结论P53和CD44v6在食管鳞状细胞癌中表达明显上调，其高表达预示转移性大及预后较差。

P53；CD44v6；食管鳞癌；组织芯片

食管癌是全球常见的恶性肿瘤之一，居肿瘤死亡原因的第五位[1]。在鲁西南地区食管癌的发生率逐年增高，并以鳞状细胞癌为主要病理类型。近年来随着免疫组织化学技术的发展及普遍应用，可以应用于食管癌中用来评估患者的恶性程度。本研究以P53和细胞表面黏附分子CD44v6为重点，来探讨其在食管鳞状细胞癌中的表达意义。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料收集2012年1—12月山东菏泽市立医院病理科石蜡标本70例。其中食管鳞状细胞癌标本52例，男35例，女17例，平均年龄65.2岁;食管炎症标本18例，男11例，女7例，平均年龄54.1岁。食管癌病例来自外科手术切除标本，食管炎症病例来自胃镜活组织检查标本，所有病例均经过病理组织学检查确诊。

1.2 主要试剂[2]及器材即用型鼠抗人P53单克隆抗体、即用型鼠抗人CD44v6单克隆抗体，PV-9000通用免疫组化二步法检测试剂盒，EDTA抗原修复液（pH值9.0），DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂均由院病理科提供。

1.3 构建组织芯片[3]使用组织芯片仪制备6行×5列的受体蜡块，在石蜡标本上标记并采集组织填塞入受体蜡块孔内，每个病例取双标本以防组织丢失，第一行头四孔填塞白蜡造成组织空缺作为标本定位依据。每个受体蜡块容纳26个组织，共计13例标本。食管癌组织构建2个组织芯片，56度烤箱内反复熔蜡成为一体，和食管炎活检组织一起4μm连续切片备用。

1.4 免疫组织化学染色[4]将切片脱蜡水化，乙二胺四乙酸（EDTA）微波抗原修复，3℅H2O2室温孵育阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗P53或CD44v6，37℃孵育2小时。二抗滴加严格按照说明书步骤进行；DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 结果判断P53为胞核染为淡黄至棕黄色，CD44v6的阳性着色为胞膜出现黄色至棕黄,。根据显色的程度来判断阳性程度：标本无黄色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕色为3分；根据阳性细胞在观察细胞中所占的比例分为：阳性细胞数＜10%为1分，10%～50%为2分；51%～75%为3分，＞75%为4分。两类分数乘积的结果：0～3分为（-），4～6分为（+），6～8分为（++），8分以上为（+++）。+～+++均判定为阳性[5]。

1.6 统计学处理采用SPSS19.0统计软件对所有计数资料行χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性检验。

2 结果

2.1 P53和CD44v6的表达P53表达于细胞核内，呈淡黄色至棕黄色分布（见图2），其在52例食管鳞状细胞癌组织中的阳性率为67.3%，18例食管炎对照组织中阳性率为22.2%，P53在食管鳞癌中的表达高于食管炎对照组中的表达（P＜0.05）。CD44v6表达于细胞膜，呈淡黄色至棕黄色分布（见图3），52例食管鳞癌组织中CD44v6的阳性率为77.0%，远高于18例食管炎对照组中的阳性率（16.7%），CD44v6在食管鳞状细胞癌组织中的表达远高于食管炎症组织（P＜0.05）。

2.2 P53与CD44v6的表达及与临床病理指标的关系1）按性别分组：食管鳞癌组52例，其中男35例，P53阳性26例，阴性9例，CD44v6阳性29例，阴性6例；女17例，P53阳性9例，阴性8例，CD44v6阳性11例，阴性6例。2）按年龄分组：食管鳞癌组52例，其中小于60岁20例，P53阳性14例，阴性6例，CD44v6阳性15例，阴性5例；大于等于60岁32例，P53阳性21例，阴性11例，CD44v6阳性25例，阴性7例。3）按肿瘤类型分组：食管鳞癌组52例，其中高中分化腺癌29例，P53阳性19例，阴性10例，CD44v6阳性21例，阴性8例；低分化腺癌23例，P53阳性16例，阴性7例，CD44v6阳性19例，阴性4例。4）按侵袭程度分组：食管鳞癌组52例，其中有淋巴结转移34例，P53阳性28例，阴性6例，CD44v6阳性30例，阴性4例；无淋巴结转移18例，P53阳性7例，阴性11例，CD44v6阳性10例，阴性8例。P53和CD44v6的表达与年龄、性别、肿瘤类型等因素无明显相关，与淋巴结是否转移明显相关（P＜0.05），即P53和CD44v6在发生淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中的表达明显增高。

2.3 P53和CD44v6表达的关系35例P53表达阳性的病例中CD44v6阳性数为29例，阴性数为6例，17例P53表达阴性的病例中CD44v6的阳性数为11例，阴性数为6例，采用Spearman相关性检验得出r= 0.202，P=0.151，证实P53与CD44v6在食管癌中的表达无明显相关性（P＞0.05）。

3 讨论

肿瘤是一个多步骤和多基因共同作用造成的结果[6]，其中癌基因的激活与抑癌基因的失活是一个重要的因素。P53基因有3种类型，分别为野生型、突变型和介于两者之间的杂合子状态[7]。野生型P53参与基因的合成及损伤修复、调控细胞周期，在细胞增生分化、细胞凋亡的诱导及维护细胞基因组完整性的过程中发挥着重要作用。而突变型P53基因就失去了抑制肿瘤的功能，P53蛋白的作用完全失活[8]，生物体内的肿瘤中常常出现野生型P53基因丢失和（或）突变，野生型P53在体外可抑制病变癌基因和细胞癌基因的转化过程，提示其具有抑癌的功能[9]。P53是细胞凋亡过程中的重要调控因子，发生突变与食管鳞癌的发生密切相关。

在本研究中，P53蛋白在食管鳞状细胞癌中的阳性率显著高于其在食管炎中的阳性率，证明在食管鳞癌组织中P53表达增高（P＜0.05），并与淋巴结的转移密切相关，提示P53阳性的鳞癌病例更易发生肿瘤浸润转移，预后更差。在性别、年龄及肿瘤类型的表达中P53无显著性差异，这与朱东兵等[10]的研究稍有不符。

CD44近年来在肿瘤分子生物学领域研究较多，与肿瘤复发、转移等过程密切相关，其亚型CD44v6是第一个被发现与肿瘤转移相关的CD44黏附分子，是一种分布广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，它能介导细胞与细胞、细胞与基质之间的特异性黏附过程，在多种肿瘤中表达，上调，能够改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，显著增强肿瘤细胞的侵袭转移能力[11]，目前，对于CD44v6在食管鳞癌癌中的研究在国内并不多见。在本组实验当中，相对于食管炎对照组，CD44v6在食管鳞癌中的表达增高（P＜0.05），并且在淋巴结转移组中的阳性率显著高于无淋巴结转移组（P＜0.05），与性别、年龄和肿瘤类型等临床病理指标无显著性差别。

对于P53和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达情况作相关性分析，二者并不同步（r=0.202，P＞0.05），因此对于P53表达阳性的食管鳞癌病例具有更高转移潜能的推论还需进一步证实。

正常组织中P53蛋白的表达很少，而原位癌时P53蛋白的阳性检出率高达20%，故P53蛋白阳性的食管炎患者应定期复查，密切随访[12]。最新研究认为，食管癌变过程中P53基因突变和蛋白产物的积聚先于肿瘤的浸润，是癌变过程中的早期事件。苗成立[13]等研究发现P53蛋白在癌远旁组织，癌近旁组织及食管癌灶中阳性率逐步提高，提示P53参与食管癌变过程的可能性大，配合黏附分子CD44v6的联合免疫组化检测，一来可以应用于早期食管癌或癌前病变的筛查，二来可以更精确的判断食管鳞癌的恶性程度和预后，有利于为患者制定更合理的治疗方案。

本研究采用了制作组织芯片的技术方法，保证了实验条件的同步性，得到的结果较为可靠，下一步将继续收集食管鳞癌病例，补充病例数量，进一步完善结果。

图1：食管鳞状细胞癌（HE，×20）

图2：P53在食管鳞癌中的阳性表达（PV-9000，×20）

图3：CD44v6在食管鳞癌中的阳性表达（PV-9000，×20）

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Clinicopathological Significance of P53 and CD44v6 Expression in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

Gao Jie1,Liu Wan2,Cao Dan3,Gao Huiying1(1Heze Medical College,Heze 274000，Shandong;2The People's Hospital of Dingtao County；3Heze Municipal Hospital)

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of P53 and CD44v6 in esophageal squa⁃mous cell carcinoma and clinicopathological parameters,and to analyze its relationship with tumor invasion and metastasis.MethodsMaking tissue microarray and using immunohistochemical PV-9000 two step method to detect 52 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues and 18 cases of esophageal inflammation of tissues,analyze the relationship be⁃tween the clinical and pathological parameters using SPSS19.0 statistical software,and to explore the correlation between P53 and CD44v6.ResultsThe expression of P53 and CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma was higher than that in esophagitis in the group(P＜0.05),and in patients with lymph node positive rate of metastasis of squamous cell carci⁃noma cases is much higher than in the no lymph node metastasis group（P＜0.05);There is no significant correlation be⁃tween the expression of P53 and CD44v6 in the esophageal squamous cell carcinoma(r=0.202,P＞0.05).ConclusionP53 and CD44v6 expression are significantly increased in esophageal squamous cell carcinoma,which suggests that high expression of metastasis and poor prognosis.

P53；CD44v6；esophageal squamous cell carcinoma；tissue chip

R735.1；R392.3

A

1008-4118（2014）03-0004-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.03.02

2014-05-29

高洁（1986-），女，主要从事护理教学与免疫病理研究。