王 英，谢 平，张 琳，刘兴奎，喻 田

（1.青岛市市立医院麻醉科，山东青岛 266011；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义 563003）

磷酯酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidy qinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K/Akt）途径和细胞外调节激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）途径共同组成了再灌注损伤挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）途径，在心肌缺血/再灌注损伤中起重要的保护作用。目前，在离体动物的实验中发现钾通道开放剂（potassium channel openers，KCOs）的心肌保护作用是通过胞膜KATP通道（sarcolemmal ATP sensitive potassium channel，sarc-KATP）和线粒体 KATP通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mito-KATP）而实现的，并认为后者起主要作用。然而，在特异性mito-KATP开放剂二氮嗪（diazoxide，DZ）后处理减轻离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤中，是否通过RISK途径而起到保护作用还鲜有报道。本研究拟采用Langendorff离体心脏灌注模型，应用DZ行药物后处理，观察其对缺血/再灌注心脏功能的影响，并探讨DZ后处理是否通过激活RISK信号通路减轻离体大鼠缺血/再灌注损伤。

1 材料

1.1 实验动物及分组 健康Sprague-Dawley成年大鼠32只（♀♂各半，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，清洁级，证书号：SCXK（军）2002008，随机分为正常组（NOR）、对照组（CON）、二氮嗪后处理组（DZ）、LY拮抗二氮嗪组（DZ＋LY）。

1.2 主要试剂及仪器 Akt、Phospho-Akt、p70S6、Phospho-p70S6、eNOS、Phospho-eNOS、p44/42 MAP Kinase、Phospho-p44/42 MAP Kinase兔抗大鼠多克隆抗体（均为 CST公司产品），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔 IgG（DakoCytomation公司），预染蛋白分子marker（Biolabs公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），二氮嗪（diazoxide）、LY294002（LY）、二甲基亚砜（DMSO）、甲叉双丙烯酰胺（bis-Acr）、三羟甲基氨基甲烷（hydroxymethyl aminomethane，Tris）、N-2-羟-酸 哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）均为 Sigma公司，其他生化试剂为国产分析纯；Langendorff离体心脏灌注模型（西班牙，PanLab公司）、Powerlab/8SP实验数据采集系统（澳大利亚，ADInstrument公司）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf，5804R型）、-80℃低温冰箱（Forma，美国）、ELX-800酶标仪（BIO-TEC.INC，美国）、Mini Trans-Bloe电泳仪（BIO-RAD，美国）、全自动凝胶图像分析仪（美国Syngene公司）。

1.3 主要液体配制 ①Kerbs-Henseleit缓冲液（成分单位：mmol· L-1，NaCl：118.00，KCl：4.75，CaCl2：2.50，NaHCO3：24.80，MgCl26H2O：1.19，KH2PO4：1.19，glucose：11.1）；ST.Thomas停跳液（成分单位：mmol·L-1，NaCl：110.00，KCl：16.00，CaCl2：1.20，MgCl2：16.00，NaHCO3：10.00 pH 7.8）；②8%SDS-PAGE分离胶30%丙烯酰胺、1.5 mol·L-1Tris缓冲液（pH 8.8）、10%APS、10%SDS、TEMED及5%SDS-PAGE积层胶；③ 电泳液（25 mmol·L-1Tris、250 mmol·L-1甘氨酸、0.1%SD）及电转缓冲液（25 mmol·L-1Tris base、0.2 mol·L-1甘氨酸、20%甲醇）；④ PBS-T缓冲液 0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液加0.1%Tween-20。

2 方法

2.1 离体大鼠Langendroff全心缺血/再灌注模型的建立 大鼠ip给予戊巴比妥钠40 mg·kg-1麻醉，肝素钠500 U·kg-1抗凝，迅速开胸取心脏，立即放入预冷的K-H液（4℃），轻轻挤压心脏洗净残留血液，液面下主动脉插管，固定置于Langendorff灌注管口。用37℃预先氧平衡的K-H液5.80kPa心脏逆行灌注，心脏跳动后于左心耳剪一小口，将带有乳胶水囊的测压管经二尖瓣插入左心室，连接Powerlab/8SP生物机能试验压力换能器系统，调节水囊使LVEDP为0.93kPa。

2.2 灌注方案 离体心脏37℃的K-H液平衡灌注20 min，平衡后监测 HR＞200次/分、LVSP＞10kPa、室性早搏＜2个/分，未达条件者舍弃。NOR组平衡后无处理续灌70 min；CON组平衡后，缺血40 min，再续灌30 min；DZ组于再灌注开始即刻，主动脉逆灌50μmol·L-1二氮嗪5min；DZ＋LY组于再灌注开始即刻主动脉灌注LY 15μmol·L-1持续5 min后，二氮嗪后处理5 min；除去NOR组均给予灌注4℃ST.Thomas停跳液10 ml·kg-1，继之停止灌注泵造成全心缺血，所有心脏在常温下缺血40 min后，再次灌注37℃含氧灌注液30 min后，取左室组织迅速置于液氮中保存，分别于平衡20 min末和再灌注30 min末时采集心脏功能各项参数。

2.3 心脏功能测定 各组分别于平衡末和再灌注30 min末测定下列心脏血液动力学参数：心率（heart rate，HR）、冠脉流量（coronary flow，CF）、左心室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室内压上升最大速率（themaximum rate of increase of left ventricular pressure，＋d p/d tmax）和左心室内压下降最大速率（the maximum rate of decrease of left ventricular pressure，-d p/d tmax）。

2.4 蛋白质的提取及W estern blot检测心肌Akt、P70S6K、eNOS、ERK磷酸化水平 从液氮中取出心肌组织称量，按3 ml·g-1比例加入4℃组织裂解液（50mmol·L-1Tris.HCl、pH 7.4、1 mmol·L-1PMSF、50 mmol·L-1NaF、150 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1EDTA、0.45mmol·L-1EGTA、1%Triton X-100、2 m l·g-1aprotinin、2 m l·g-1leupeptin、5 mg·L-1pepstatin、1%Tween-20），冰浴中剪碎组织，超声匀浆至组织成糜状，静置1 h，14 000×g离心1 h，取上清，14 000×g再离心30 min，取出上清液，用BCA法测定待测样品的蛋白浓度（按BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书操作），最后取上清蛋白分装。分别根据目的蛋白分子量配制8%SDS-PAGE分离胶，上样量为20μg/20μl，按标本与上样缓冲液体积4∶1加入5X上样缓冲液，总体积25μl。混匀后煮沸5 min，上样电泳、转膜，一抗孵育过夜，二抗标记孵育1 h，荧光显色剂染膜，X线片曝光，显影、定影。采用Image-ProPlus图像分析软件（Version4.1，Media Cybernetics，LP，USA）对蛋白条带进行半定量分析。

2.5 统计学处理 实验数据按完全随机对照设计的要求收集整理，所有数据用¯x±s表示，各组间数据计量资料用SPSS13.0统计软件进行单因素方差（ANOVA）分析，处理前后数据用配伍t检验。

3 结果

3.1 离体大鼠心脏心功能 4组离体鼠心平衡末、再灌注末30min时心率（HR）、冠脉流量（CF）、左心室发展压（LVDP）、左心室舒张末压（LVEDP）、压力瞬时最大变化率（±d p/d tmax）结果如下（Tab 1～3）。各组间平衡末比较差异无显著性（P＞0.05）；NOR组组内再灌注30 min与平衡末比CF差异无显著性，余各组组内再灌注30 min与平衡末比 HR、LVDP、±d p/d tmax明显降低（P＜0.01），LVEDP明显增加（P＜0.01）；DZ组再灌注末 HR、CF、LVDP、±d p/d tmax与CON组、DZ＋LY组比明显增加（P＜0.01），LVEDP明显降低（P＜0.01）。

Tab 1 Change of isolated heart HR and CF in four groups（±s，n＝8）

Tab 1 Change of isolated heart HR and CF in four groups（±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs20min-equilibration.

Group At theend ofequilibration HR/beats·min-1 CF/ml·min-1 At theend of reperfusion HR/beats·min-1 CF/ml·min-1 NOR 329±11 12.93±0.81 311±9☆12.34±0.57 CON 325±7 12.36±1.02 213±17☆☆ 4.16±0.52☆☆DZ 331±12 13.33±0.75 256±11＃＃△△☆☆ 10.03±0.58＃＃△△☆☆DZ＋LY 324±7 12.16±0.67 202±14**☆☆ 3.65±0.52**☆☆

Tab 2 Change of isolate hearts LVDP and LVEDP in four groups（x¯±s，n＝8）

Tab 2 Change of isolate hearts LVDP and LVEDP in four groups（x¯±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs20min-equilibration.

Group At the end ofequilibrantion At the end of reperfusion LVDP/kPa LVEDP/kPa NOR 10.85±0.65 1.01±0.03 9.14±0.66☆ 1.27±0.09 LVDP/kPa LVEDP/kPa☆☆CON 10.99±0.43 1.01±0.04 3.76±0.45☆☆ 4.39±0.43☆☆DZ 11.39±0.47 0.98±0.02 7.27±0.85＃＃△△☆☆2.58±0.22＃＃△△☆☆DZ＋LY 11.10±0.54 0.99±0.03 2.98±0.54**☆☆ 4.62±0.53**☆☆

Tab 3 Change of isolate hearts＋d p/d t m ax and－d p/d t m ax in four groups¯x±s，n＝8）

Tab 3 Change of isolate hearts＋d p/d t m ax and－d p/d t m ax in four groups¯x±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs 20min-equilibration

Group-1 NOR 255±18 212±16 225±13☆☆ 172±12 At theend ofequilibrantion＋d p/d t max/kPa·s-1-d p/d t max/kPa·s-1 At theendof reperfusion＋d p/d t max/kPa·s-1-d p/d t max/kPa·s☆☆CON 263±16 205±22 115±21☆☆ 47±8☆☆DZ 273±18 235±17 165±12＃＃△△☆☆ 113±11＃＃△△☆☆DZ＋LY 257±18 209±13 91±21**☆☆ 46±12**☆☆

3.2 W estern blot检测心肌 Akt、P70S6K、eNOS、ERK磷酸化水平 再灌注末DZ组Akt、P70S6K、eNOS磷酸化水平明显高于NOR组、CON组、DZ＋LY组（P＜0.01），但各组ERK的磷酸化水平没有明显区别，p-Akt/t-Akt、p-P70S6/t-P70S6、p-eNOS/t-NOS、p-ERK/t-ERK为蛋白条带灰度值的比值，见Fig 1～8。

3.2.1 Akt磷酸化表达情况 见Fig 1、2。

Fig 1 Four groupsof total Akt and phosphorylated Akt electrophoresis images

3.2.2 P70S6磷酸化表达情况 见Fig 3、4。

3.2.3 eNOS磷酸化表达情况 见Fig 5、6。

3.2.4 ERK磷酸化表达情况 见Fig 7、8。

Fig 2 Level of phosphoric acid expressions of Akt in LV of rats from four groups（¯x±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

Fig 3 Four groups of total P70S6 and phosphorylated P70S6 electrophoresis images

Fig 4 Level of phosphoric acid expressions ofP70S6 in LV of rats from four groups（±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

4 讨论

心肌缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是临床上常见的病理生理过程，人们对IRI的机制和抗损伤的措施进行了大量研究，其中2003年Zhao等［1］提出了缺血后处理（ischemicpostconditioning，IPTC），并在动物模型上证实了后处理的保护效果，IPTC能够有效地减轻再灌注损伤，而药物后处理是在缺血后再灌注之前给予某种药物使之产生与IPTC相似的保护效果。目前研究表明，二氮嗪、挥发性麻醉药、胰岛素、缓激肽等药物都具有后处理的保护作用［2-4］。二氮嗪［5］、七氟醚［6］及多种细胞因子均可通过激活PI3K-Akt信号转导系统，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞存活，其中Akt活化是这些信号转导通路发挥心脏保护作用的关键。目前PI3K/Akt和ERK1/2作为治疗新靶点日益受到关注。具体的说，IPTC激活RISK途径，其上游可能是激活了G蛋白偶联受体如腺苷受体，尤其是A2和A3受体，其下游可能激活了GSK3β、eNOS、蛋白激酶Cε（PKCε），最终作用于线粒体和钾离子通道，减少mPTP开放和增加钾离子通道开放［7-9］，从而保护心肌细胞抵抗细胞内和线粒体内钙超载、氧化应激反应和ATP耗竭。

本研究结果表明，与CON组和DZ＋LY组比，DZ后处理组，其 LVDP、HR、CF、＋d p/d tmax、-d p/d tmax明显增加（P＜0.01），LVEDP明显降低（P＜0.01），能明显改善离体缺血/再灌注大鼠心脏的功能，提示DZ后处理能有效减轻IRI，具有心肌保护作用，表明mito-KATP敏感性钾通道在后处理中起到关键作用。本实验中，再灌注末DZ组 PKB/Akt、eNOS、P70S6K磷酸化水平的表达明显高于 NOR组、CON组，而PI3K抑制剂LY294002可取消这种作用，并取消DZ改善心功能的效应。各组ERK1/2磷酸化水平的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。表明二氮嗪后处理可能激活了PI3K-Akt信号途径，并且也激活其下游靶点eNOS、P70S6K，使它们磷酸化水平增强，从而抑制心肌细胞的凋亡，产生心肌保护效应。但各组ERK的磷酸化水平没有明显区别，提示DZ后处理并没有影响ERK1/2磷酸化的表达。

Fig 5 Four groups of total eNOS and phosphorylated eNOS electrophoresis images

Fig 6 Level of phosphoric acid expressions of eNOS in LV of rats from four groups（±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

Fig 7 Four groups of total ERK and phosphorylated ERK electrophoresis images

Fig 8 Level of phosphoric acid expressions of ERK in LV of rats from four groups（±s，n＝3）

目前对于PI3K/Akt和ERK1/2在后处理中的相对重要性仍存有争议。Darling等［10］在兔离体心脏缺血后处理模型的研究中发现后处理激活的是ERK1/2，而非PI3K/Akt。而另一项关于缓激肽药理后处理的研究则表明ERK1/2就是PI3K/Akt的一个下游底物［11］。这些观点的分歧可能与实验动物、后处理的方式以及所取标本的部位不同有关。在以往的研究中［12］也显示，PI3K/Akt和 ERK1/2的活化无论是在心肌肥厚还是在缺血或衰竭的心脏中，都是一个复杂的多相的时间点过程。虽然本实验表明ERK1/2没有被DZ后处理所激活，但是不能排除ERK1/2在后处理中的心肌保护作用，因为我们不能排除可能积累的磷酸化在特定的亚细胞上起作用，而且蛋白质磷酸化与非磷酸化的过程本身就是个可逆的过程，在实验中也不能确定磷酸化只在单一的时间点内发生，所以对于DZ后处理是否激活ERK1/2途径，其机制如何还有待进一步研究。

本研究还发现，各组 PKB/Akt、P70S6K、eNOS磷酸化表达的变化与其对应的离体鼠心心脏功能的改变，具有一定的联系，推测DZ后处理可能是通过开放 mito-KATP通道，启动某种内源性机制激活PI3K-Akt信号途径，抑制心肌细胞的凋亡而保护心肌。因此，可以认为DZ后处理可激活PI3K-Akt信号途径，而激活的PI3K-Akt信号途径又能促使mito-KATP通道的开放，二者都能抑制心肌细胞的凋亡，协同发挥作用，最终产生心肌保护效应。

参考文献：

［1］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos M E，etal.Inhabition ofmyocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparision with preconditioning［J］.AM J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：579-88.

［2］ 段忠心，刘兴奎，喻 田.二氮嗪后处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的影响［J］.中华麻醉学杂志，2010，30（10）：1163-7.

［2］ Duan Z X，Liu X K，Yu T.Effects of diazoxide postconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts［J］.Chin JAnesthesiol，2010，30（10）：1163-7.

［3］ Meybohm P，Gruenewald M，Albrecht M，et al.Pharmacological postconditioning with sevoflurane after cardiopulmonary resuscitation reducesmyocardial dysfunction［J］.Crit Care，2011，15（5）：241-6.

［4］ Burley D S，Baxter G F.Pharmacological targets revealed by myocardial postconditioning［J］.Curr Opin Pharmacol，2009，9（2）：177-88.

［5］ 赵其宏，张 颖，梁启胜，等.二氮嗪后处理对缺血/再灌注心肌的保护作用及其与PI3K/Akt信号通路的关系［J］.中国药理学通报，2012；28（1）：127-31.

［5］ Zhao Q H，Zhang Y，Liang Q S，et al.Protective effect againstmyocardial ischemia/reperfusion induced by diazoxide-postconditioning and its interaction with PI3K/Akt signaling pathway［J］.Chin JAnesthesiol，2012，28（1）：127-31.

［6］ Ma L L，Zhang F J，Kong F J，et al.Hypertrophied myocardium is refractory to sevoflurane-induced protection with alteration of reperfusion injury salvage kinase/glycogen synthase kinase 3βsignals［J］.Shock，2013，40（3）：217-21.

［7］ Ma X J，Yin H J，Guo C Y，et al.Ischemic postconditioning through percutaneous transluminal coronary angioplasty in pigs：roles of PI3K activation［J］.Coron Artery Dis，2012，23（4）：245-50.

［8］ Yao SY，Nataran C，Sriram S.nNOSmediated mitochondrial injury in LPS stimulated oligodendrocytes［J］.Mitochondrion，2012，12（2）：336-44.

［9］ Zatta A J，Kin H，Lee G，et al.Infarct sparing effect ofmyocardial postconditioning is dependent on protein kinase C signalling［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：315-24.

［10］Darling C E，Jiang R，Maynard M，et al.Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts：role of ERK1/2［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（4）：1618-26.

［11］Yang X M，Krieg T，Cui L，et al.NECA and bradykinin at reperfusion reduce infarction in rabbitheartsby signaling through PI3K，ERK，and NO［J］.JMol Cell Cardiol，2004，36（3）：411-21.

［12］Rothermel B A，Berenji K，Tannous P，et al.Differential activation of stress-response signaling in load-induced cardiac hypertrophy and failure［J］.Physiol Genomics，2005，23（1）：18-27.