冉茂良,陈斌,尹杰 ,杨岸奇,蒋明

1. 湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128;

2. 中国科学院亚热带农业生态研究所,中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室,湖南省畜禽健康养殖工程技术中心,农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站,长沙 410125;

3. 中国科学院研究生院,北京 100049

1993年 Lee等[1]首次在线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了 microRNA (miRNA)—Lin-4基因,Reinhart等[2]于2000年发现了线虫的另一个miRNA—Let7基因及其靶基因lin-41,并证实了它们在线虫发育过程中的时间控制作用。之后,科研人员开始广泛关注 miRNA这一全新的后转录基因沉默的重要调节因子,其调节机制主要是通过碱基互补配对原则与靶mRNA结合后形成双链RNA,从而诱导靶mRNA降解或抑制其翻译过程[3,4]。目前miRBase已经收录了多种生物的 miRNA,大量研究证实miRNA在生物体生长、发育和凋亡等过程中具有重要的调控意义[5]。同生物体其他器官和组织一样,睾丸的正常发育和精子生成也会受到激素、生长因子和酶或蛋白质的严格调控[6],研究表明,miRNA也调控着睾丸的正常发育和精子生成过程。目前,动物睾丸发育和精子生成相关 miRNA的研究方法主要集中在综合利用各种探针设计和标记技术,同时结合微阵列芯片、高通量测序、实时荧光定量 PCR等技术以提高检测通量、灵敏度和特异性[7]; 研究的主要内容多集中于睾丸 miRNA表达的种属差异性和阶段特异性、睾丸 miRNA的表达调控以及一些miRNA对精子生成的调节作用。本文综述了近年来睾丸发育和精子生成相关miRNA的研究进展,以期为后续的相关研究提供参考。

1 睾丸miRNA表达的物种差异性

动物体内许多miRNA的表达模式是固定的,但在不同物种和组织中这种固定的表达模式却存在着差异。通过对人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和荷斯坦牛(Holstein Friesian)等动物不同组织miRNA表达谱的比较发现,miRNA在睾丸中的表达存在特异性,主要表现为种类和数量上的差异(表 1)[8～10]。

研究 miRNA组织特异性表达,也有助于解析miRNA在不同器官和组织中的功能。Liu等[8]对人不同组织中161个miRNA的表达情况采用基因芯片技术、Real-time PCR、Northern blot和文献检索进行了研究,证实miRNA在人体组织中的表达具有特异性,并且在人体睾丸组织中检测到 112种特异性表达的 miRNA。Mishima等[9]对成年小鼠睾丸和卵巢的miRNA文库进行了测序,研究miRNA在生殖系统中的表达特点,利用RT-PCR进行验证,结果表明 miRNA在组织中的表达具有特异性,并检测到49种仅在或主要在成年小鼠睾丸组织中表达的miRNA。Huang等[10]采用 Solexa高通量测序技术对荷斯坦牛睾丸和卵巢中的 miRNA文库进行了检测,发现荷斯坦牛睾丸中有21个miRNA存在特异性表达。由此可见,睾丸miRNA在不同物种的表达存在特异性。

生物技术的不断发展有助于在睾丸组织中发现更多特异性表达的miRNA,例如高通量测序技术、miRNA表达图谱分析和生物信息学技术等[11～13]。Wu等[11]构建了成年奶山羊(Capra hircus L.)睾丸组织miRNA文库,利用 Illumina高通量检测技术,通过与miRBase 19.0中牛、羊的miRNA对比,在奶山羊睾丸组织中确定了373种保守的miRNA,并发现91种新配对的 miRNA,利用 qRT-PCR证实其中的 6种 miRNA(miR-10b、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-34c、miR-449b和miR-1468)特异性表达于奶山羊睾丸组织,并且有128种保守的miRNA在奶山羊的睾丸发育和精子生成的减数分裂过程中发挥作用。Yang等[12]采用 Solexa高通量测序技术对人正常睾丸组织的miRNA进行了测序,检测出770个已知的和 5个新的 miRNA,并利用 qRT-PCR验证了其中15个已知的(let-7f-5p、let-7a-5p、miR-34c-5p、miR-22-5p、let-7c、miR-10b-5p、miR-514b-5p、miR-34b-5p、miR-15b-5p、miR-27b-3p、miR-134、miR-15a-5p、miR-889、miR-506-3p、miR-17-5p)和5个新的 miRNA(HT-0117-3p、HT-0016-3p、HT-0072-3p、HT-0041-3p、HT-0010-5p),证实了Solexa高通量测序结果的可靠性。Abu-Halima等[13]采用 miRNA阵列分析法,发现与正常睾丸组织相比,病变组织中共有 211种 miRNA存在差异表达,而且qRT-PCR验证的结果与miRNA阵列分析结果一致。

表1 睾丸特征性表达的miRNA

2 睾丸miRNA表达的阶段特异性

动物的睾丸发育大体上经历胎儿期、幼年期、青年期和性成熟期 4个阶段,但不同动物睾丸发育的阶段又有一些相对细致的划分[14]。miRNA在睾丸不同发育阶段的表达模式也呈现出特异性,主要是数量和种类上的特异性,其正常的表达模式是睾丸发育和生精功能正常的前提。此外,研究睾丸miRNA表达的阶段特异性也能从侧面证实 miRNA对睾丸的发育、成熟和精子生成具有重要的调节作用。目前多采用基因芯片技术、高通量测序技术、生物信息学技术以及qRT-PCR对睾丸miRNA表达的阶段特异性进行研究,但基于动物模型和睾丸发育时期不尽相同,所采用的实验方法也有所差异。

Yan等[15]采用基因芯片技术对小鼠幼龄期(7 d)和成年期(56 d)睾丸中miRNA的表达进行了比较研究,利用qRT-PCR进行验证,发现19种miRNA的表达存在显著差异,在幼龄小鼠中 14种miRNA(miR-411、miR-495、miR-335、miR-434-5p、miR-337、miR-379、miR-127、miR-376a、miR-181d、miR-214、miR-181c、miR-361、let-7e、miR-181b)的表达被显著上调,5种miRNA(miR-34a、miR-29b、miR-449、miR-34b和 miR-34c)的表达被显著下调。Lian等[16]通过构建miRNA文库和Solexa高通量测序技术对军牧-1猪(Sus scrofa)幼龄期(30 d)和成年期(180 d)睾丸中miRNA的表达进行了比较研究,共发现 469种 miRNA,其中新发现 15种猪特有的miRNA,56种新的候选 miRNA; 在 469种 miRNA中有 122种在幼龄期和成年期的表达显著不同,其中对随机选取的10种miRNA(miR-9-1、miR-183、miR-122、miR-145、miR-30a、miR-199b*、let-7c、miR-221、miR-323和 miR-196)进行了 qRT-PCR验证,其结果与 Solexa测序分析结果基本一致,仅miR-9-1和miR-196的两个结果趋势一致。Lou等[17]采用miRNA芯片技术对长白猪青年期(60 d)和成年期(180 d)睾丸中 miRNA 的表达进行了研究,发现129种miRNA的表达存在显著差异,在成年期有51种miRNA的表达上调,78种miRNA的表达下调,对随机选取的 9 种 miRNA(miR-663、miR-1、miR-762、miR-143、miR-638、miR-145、miR-542-3p、miR-155和miR-705)进行了qRT-PCR验证,其中仅miR-145呈现出相反的表达谱,其余8种miRNA的表达谱均相同,证明两种方法所得的结果具有较高的一致性。Torley等[18]采用生物信息学技术和 Real-time PCR技术研究并验证了绵羊(Ovis aries L.)妊娠胎儿在妊娠初期(第42 d)和中期(第75 d)睾丸中miRNA的表达,共发现 30 种 miRNA的表达存在显著差异,其中 13种 miRNA(miR-302d、miR-200c、miR-222、miR-200b、miR-362、miR-99b、miR-485-5p、 miR-382、miR-149、miR-15b、miR-92、miR-17-5p和 miR-107)在妊娠初期的表达显著升高,17种 miRNA(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-33、miR-211、miR-193a、miR-19a、miR-19b、miR-199b、miR-27a、miR-199a、miR-143、let-7g、miR-22、miR-30e-5p、miR-204、miR-30b和let-7e)在妊娠中期的表达显著升高。Zhang等[19]采用芯片技术和qRT-PCR技术研究并验证了人在新生、成年(25岁)和老年(75岁)3个不同时期睾丸中miRNA的表达,发现新生胎儿、成年人和老年人睾丸中分别有 251、109和 125种miRNA表达,有127种miRNA(如miR-375、miR-208、miR-494、miR-425和 miR-198等)特定表达于新生胎儿睾丸中,而仅有3种(miR-24、miR-27、miR-21)和2种(miR-221、miR-222)miRNA特定表达于成年和老年人的睾丸中,此外有 106种 miRNA(如miR-125b、miR-143、miR-23b和 miR-26a等)广泛表达于人体睾丸的这3个阶段。

综上所述,目前多采用在高通量克隆测序和基因芯片技术等基础上利用RT-PCR或qRT-PCR对实验结果进行验证,研究睾丸中miRNA表达的阶段特异性。但是基于取样的方式、样本量以及实验结果验证量等因素的限制,研究结果与miRNA在实体中的表达模式会有不同程度的差异,从而对描绘睾丸miRNA在实体中的表达状况造成一定程度的困难,有待于科研工作者进一步研究制定更为合理的方法以研究睾丸miRNA的表达模式。

3 睾丸miRNA的表达调控

睾丸 miRNA不仅对睾丸基因转录后的表达发挥调节功能,其自身的表达也会受到细胞内外相关因素的调控,从而对睾丸发育和精子生成产生影响。目前,关于睾丸miRNA的转录调节和转录后调节的研究相对较少,但也有一些实验证实了细胞内外的一些因素(例如激素、转录因子、酶和蛋白等)可以调控睾丸中miRNA的表达。

研究表明,激素可以调节睾丸细胞miRNA的表达。Hu等[20]采用芯片技术和 qRT-PCR技术证实了大鼠的一些睾丸类固醇生成细胞中的 miRNA受激素调节,并且其中的一些miRNA受到多个激素的调控; 促肾上腺皮质激素(Adreno cortico tropic hormone,ACTH)上调 miR-212、miR-182、miR-183、miR-132和 miR-96而下调 miR-466b、miR-214、miR-503 和 miR-27a 的表达; 17α-雌二醇(17α-E2)上调 miR-212、miR-183、miR-182、miR-132、miR-370、miR-377和 miR-96而下调 miR-125b、miR-200b、miR-122、miR-466b、miR-138、miR-214、miR-503和 miR-27a的表达; 地塞米松(dexamethasone)上调miR-183而下调 miR-200b、miR-122、miR-19a、miR-466b 和 miR-27a 的表达。Panneerdoss等[21]研究表明,雄激素调节睾丸支持细胞中的一些miRNA的表达是通过调节支持细胞或生殖细胞特定基因的表达而实现的; 通过雄激素抑制和雄激素替代证实雄激素能够调节小鼠睾丸支持细胞中一些 miRNA的表达,上调 miR-201、miR-547、miR-871-3p、miR-878-5p、miR-880、miR-463、miR-741、miR-471-5p、miR-753a、miR-375、miR-25、miR-34c、miR-203和 miR-449a而下调 miR-18a*、miR-328、miR-335-3p和 miR-468的表达。此外,Dai等[22,23]敲除雄性小鼠圆形精子细胞中的GRTH基因(促性腺激素调节的睾丸特异 RNA 解旋酶基因)发现,相比于正常小鼠,19个miRNA的表达水平显著升高,包括Let-7家族、miR-470、miR-34c以及睾丸特异表达的 miR-469,miRNA的初级前体转录水平也显著升高,如 pri-let-7d、pri-let-7g、pri-miR-34c、pri-miR-469以及pri-miR-470; 证实GRTH在睾丸精子细胞 miRNA的成熟过程中发挥着重要的负调控作用,以维持精子发生过程中成熟miRNA分子的动态平衡,从而保证精原细胞能够顺利发育至成熟的精子。

酶或蛋白质同样也可以调节睾丸细胞 miRNA的表达。Wu等[24]研究表明,雄性生殖线中缺乏第2类核糖核酸酶Ⅲ不仅会阻碍成熟 miRNA的形成而且还会导致雄性不育。Tian等[25]研究表明,调低人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)中脆性 X智力低下蛋白(FMRP)的表达可以通过减弱 miR-383与FMRP之间的相互作用而增强miR-383对细胞分化的抑制作用,从而证实FMRP对miR-383的功能存在负向调节的作用。Ali等[26]研究表明,APOBEC3(Apolipoprotein B mRNA-editing enzym,catalytic polypeptide like 3)能够阻滞 DND1(一个RNA结合蛋白,可介导生殖细胞的存活,抑制生殖细胞肿瘤的形成)的功能以恢复 miR-372和miR-206分别对LATS2和CX43基因的抑制作用,并证明APOBEC3能够通过调节DND1的功能以调控细胞中miRNA介导的翻译调控。此外,转录因子对睾丸细胞miRNA的表达也起着调节作用。Niu等[27]在证实 miR-21对维持睾丸精原干细胞数量具有重要作用的基础上,过表达Etv5基因(转录因子Ets差异基因5)可促进miR-21表达,从而证实ETV5(一种转录因子)对调节 miR-21在睾丸精原干细胞中的表达具有重要作用。

4 miRNA对精子生成的调节作用

原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)来源于胚外上胚层或内胚层,作为哺乳动物生殖细胞系(Germ cell lineage)的起源,PGCs形成后即迁移至生殖嵴(胚胎性腺)并在来源于中胚层的体细胞之间定植,随性腺的分化而大量增殖并分化,并逐渐过渡到前精原细胞(Prospermatogonia),随后休眠于细胞周期的G1/G0期[28]。在动物出生后的一段时间内,前精原细胞大量增殖并分化为精原细胞,并且也会有少量的精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)存在于精原细胞群体中以维持体内精子发生[29]。精原细胞通过一次有丝分裂形成初级精母细胞、两次减数分裂形成精子细胞,最终在经历一系列形态变化过程后形成成熟的精子。研究证实miRNA对精子生成具有重要的调控作用(表2),且这种调控作用贯穿于精子生成的整个过程中。如图 1所示,目前关于 miRNA对原始生殖细胞至精原细胞的调控作用的研究较多,而对初级精母细胞至成熟精子细胞的研究还较少。

表2 对精子生成具有调控作用的miRNA

图1 部分miRNA在精子生成过程中的作用位点(参考文献[28]并修改)

调控PGCs增殖和发育的miRNA较多,如miR-19a[30]、miR-19b[30]、miR-141[31]、miR- 200a[31]、miR-200c[31]、 miR-let-7 家族(a,d,e,f,g)[31～33]、miR-17-92 簇[34]、miR-106b-25 簇[34]、miR-302-367外,miRNA通常以间接的方式对PGCs进行调控,肿瘤抑制因子 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是miR-19a和miR-19b的作用靶标之一,而 PTEN可以负向调控 PGCs增殖[39,40],因此 miR-19a和 miR-19b可以通过调节PTEN的表达而调控 PGCs的增殖。基于不同的miRNA具有相同的靶标,因此 miRNA簇内部成员miRNA以及miRNA簇之间均存在协同作用以调控PGCs的增殖和发育,miR-141、miR-200a和miR-200c属于miR-200超家族成员,它们的种子序列相似,被认为在 PGCs的增殖和发育过程中存在协同作用[38,31],此外Let-7家族、miR-125a和miR-9对共同的作用靶标—LIN28(miRNA调节蛋白,一种高度保守的 RNA 结合蛋白)有类似的调控作用,从而推测它们对PGCs的调控存在协同作用[38]。

miRNA对由PGCs发育而来的精原干细胞和精原细胞也有调控作用。对精原干细胞起调控作用的miRNA 有 miR-Let-7家族(7,a,b,c,d,e)[41]、miR-21[27]、miR-34c[42]、miR-148[33]等,对精原细胞起调控作用的 miRNA有 miR-106b-25簇[32]、miR-17-92 簇[32]、miR-221[44]、miR-222[44]和 miR-449[45]等。miRNA对精原干细胞和精原细胞的调控也存在阶段特异性。Huszar等[43]研究发现,miR-146依赖维甲酸(Retinoic acid,RA)信号对精原干细胞的分化具簇[35]、miR-290-295 簇[36]、miR-323[31]和 miR-9[31,37]等。miRNA对PGCs的调控存在时相性,如miR-141、miR-200a、miR-200c和miR-323等调控PGCs的早期阶段,而 miR-9等调控 PGCs的晚期阶段[38]。此有重要的调节作用,其在未分化的精原细胞中的转录水平是分化过程中的精原细胞的180倍。miRNA对精原干细胞和精原细胞的调控是通过调节靶标而介导实现的。Yang等[44]研究发现,未分化的精原干细胞向分化状态转化的数量受到 KIT受体的调控,而miR-221和miR-222则会抑制KIT受体mRNA和蛋白表达量,从而在保持哺乳动物的精原细胞处于未分化状态中起着至关重要的作用; Bao等[45]研究发现,miR-449和miR-34家族中的miR-34b/c共同作用于E2F转录因子视网膜母细胞瘤蛋白通路中的基因,从而实现对雄性生殖细胞的调控作用。此外,miRNA簇或miRNA也协同调控精原干细胞和精原细胞的增殖与发育。Tong等[34]研究发现,雄性生殖细胞中缺乏 miR-17-92簇时会使 miR-106b-25簇中的 miRNAs的表达量剧增,从而表明 miR-106b-25簇和 miR-17-92簇对精原干细胞的调控存在协同作用。

miRNA对精子生成过程中初级精母细胞至成熟精子细胞这一发生阶段也存在调控作用。Yu等[46]研究发现,miR-122a能够调节生殖细胞过渡蛋白2(TNP2)的表达而对精子生成的后期阶段发挥调控作用。此外也有研究表明,miR-13可以通过增强生精细胞特异性标志物的表达进而促进晚期精子发生[42]。miR-24通过作用于甲基化 CpG结合域蛋白6(MBD6)和组蛋白2A家族成员X(H2AX)两个靶标,而在精子生成过程中的减数分裂时发挥潜在的调控作用[47]。miR-888对维持成熟精子的结构和鞭毛的蠕动具有重要的作用[48]。尽管后期减数分裂和单倍体生殖细胞是精子生成过程中产生 miRNA的主要源头[49],但是目前关于 miRNA对精子生成过程中初级精母细胞至成熟精子细胞这一发生阶段的调控作用的报道却较少。此外,miRNA调控精子发生过程的阶段或时相特异性以及其对精子发生的调控途径也需进一步研究。

miRNA不仅在动物睾丸中的表达具有种属差异性和发育阶段特异性,其本身在睾丸中的表达受到来自体内外各种因素的调控,而且对动物精子生成也具有重要的调控作用。以 Let-7家族为例,对miRNA在动物睾丸发育和精子生成过程中表现出的种属和发育阶段特异性以及其自身表达调控和对精子生成的调控作一详细阐述。

Let-7家族成员主要包括 Let-7a-1、Let-7a-2、Let-7a-3、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f-1、Let-7g、Let-7i以及miR-98等,已有研究表明Let-7家族对动物细胞分裂分化、器官发育、心肺系统发育和神经系统发育均有调控作用[52]。此外,如前文所述,Let-7家族成员对动物睾丸发育和精子生成也起着不同程度的调控作用。Let-7家族在睾丸中的表达存在物种差异,如表 1所示,Let-7家族中的miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-let-7a-3、miR-let-7b、miR-let-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g特异性表达于人的睾丸中,在小鼠的睾丸中仅有 let-7g-3p特异性表达,而在荷斯坦牛睾丸中却不存在特异性表达。Let-7家族在睾丸中的表达也存在阶段特异性。Lian等[16]研究表明,Let-7c在军牧-1猪幼龄期(30 d)和成年期(180 d)睾丸中的表达显著不同; Torley等[18]研究表明,Let-7g和Let-7e在绵羊胎儿妊娠中期(第75 d)的表达显著升高而在妊娠初期(第 42 d)却未发现有显著升高现象。Let-7家族在睾丸中的表达也受到体内外一些因素的调节。Dai等[22,23]研究表明,敲除小鼠圆形精子细胞中的 GRTH基因可导致 Let-7家族的表达水平以及Let-7d和Let-7g的前体转录水平显著升高; Piskounova等[53]研究表明,敲除Lin-28基因可促进Let-7的成熟体形成,从而证明Lin-28蛋白可以直接或间接在转录水平对Let-7进行负调控。此外,也有研究表明,Let-7家族(a,d,e,f,g)能够调控精子生成过程中PGCs增殖和发育,Let-7家族(7,a,b,c,d,e)能够调控精原干细胞和精原细胞的分化和增殖[32,41]。由此可见,Let-7家族成员在睾丸发育和精子生成过程中均表现出明显的调控作用,而且其自身的表达也受到体内外一些因素的调控。

5 展 望

睾丸的正常发育和生精对保障种群延续和充分利用优良种公畜的精液具有十分重要的作用,而miRNA在睾丸组织发育和精子生成的各个阶段均发挥着重要的作用,但是这方面的研究却还处于初步阶段。因此,研究miRNA对正常睾丸发育和精子生成的调控作用的意义重大,不仅为研究人类和种公畜的生殖疾病的理论基础做出了很好的补充,还为改善畜牧生产中种公畜的精液品质提供了一个新的思路和途径。

在睾丸miRNA后续的相关研究中,应当重点开展睾丸发育和精子生成相关 miRNA的表达分析和功能验证等方面的研究。对miRNA的表达谱分析应着眼于睾丸发育和精子生成的不同阶段特异性表达的 miRNA,探讨睾丸发育和精子生成过程中的miRNA与精液品质的相关性,筛选 miRNA的分子标记。而对于miRNA的功能验证,则应深入研究功能性miRNA的作用机理和睾丸miRNA的表达受到外界因素(环境因素、营养因素等)调控的机制以及怎样利用miRNA来调控种公畜睾丸健康和精液品质。应当将细胞水平和动物机体水平的试验验证有机地结合在 miRNA的研究中,探究抑制和过表达miRNA对睾丸发育和精子生成的影响。可以预见,对于种公畜而言,探明miRNA与其靶基因的关系和miRNA调控精子生成及精液品质的潜在机理,可为在畜牧生产中获得品质优良的精液和分子育种提供新的理论依据,与此同时也为治疗雄性不育、睾丸癌等各种睾丸疾病提供新的思路。

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