窦阿波， 邹存杰， 单圆鸿， 石先哲*， 许国旺

(1.中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，辽宁大连116023;2.辽宁对外经贸学院，辽宁大连116052)

近期发展起来的毛细管高效液相色谱(μ-HPLC)［1，2］是一种高效的分析方法，克服了常规高效液相色谱(HPLC)存在分离效能低，样品、流动相和固定相消耗大等缺点。对于较为稀缺的生物样品，使用μ-HPLC分析极为有利，这种方法也对环境更友好。因此其在手性分离、蛋白质及多肽分析等众多研究领域具有广阔的应用前景。μ-HPLC的关键是发展分离性能优良的毛细管色谱柱。近年来，毛细管色谱柱中发展最快的就是整体柱(monolithic column)，其是一种利用有机、无机聚合或者有机-无机杂化的方法在毛细管空柱内形成的连续床固定相色谱柱，具有优异的通透性，制备简单，分离柱压低［3－5］。随着近来功能化聚合物单体的发展，开始出现很多新型分离模式的毛细管色谱柱［6－8］，如混合模式色谱柱等，具有极好的发展前景。

混合模式色谱(mixed-mode chromatography，MMC)指的是同时应用多种作用力进行保留和分离的色谱方法［9－11］。带正、负电及非极性的物质可用离子交换和反相色谱的混合模式色谱柱同时分离［12，13］，故可以一根混合模式的色谱柱代替多根单模式的色谱柱，而且通过改变流动相条件在封闭体系中完成二维或多维的分析［9］，具有与相应多种单模式色谱填料相当或更好的分离效率。

本研究使用［2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基］二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(SPE)与乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)在100 μm内径的石英玻璃毛细管内原位聚合制备具有优良通透性能的毛细管液相色谱整体柱(SPE-co-EDMA)，详细考察了致孔剂的种类及与单体的配比、引发剂用量、聚合反应的温度、时间等因素对毛细管整体柱的通透性、孔径分布、柱效等性能的影响，同时在μ-HPLC操作模式下进行了色谱性能评价，取得了较理想的效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

毛细管电泳仪(MDQ，Beckman Coulter，美国)，纳升液相色谱仪(LC-20AD nano，Shimadzu，日本);精密 pH 计(FE-20，Mettler Toledo，瑞士)，超声波清洗仪(SB-50D，宁波新芝生物技术股份有限公司，中国)，气相色谱仪(HP9790，浙江福立分析仪器有限公司，中国)，扫描电子显微镜(JSM-6360LV，JEOL，日本)。

熔融石英毛细管(100 μm i.d.，河北永年锐泽色谱器件有限公司，中国);γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、SPE和EDMA购自Sigma-Aldrich(美国);偶氮二异丁腈(AIBN，上海试四赫维化工有限公司，中国);正丙醇、1，4-丁二醇均为分析纯(天津科密欧化学试剂公司，中国);NaOH、HCl、二氯甲烷均为分析纯(中国国药集团上海化学试剂公司，中国);甲醇和乙腈(色谱纯，Merck，美国);实验用水由Milli-Q超纯水系统(Millipore，美国)提供;流动相使用前超声脱气20 min。

1.2 毛细管整体柱的制备

1.2.1 毛细管的预处理

截取2 m长、内径100 μm的毛细管空柱，根据文献［14，15］的方法对其进行处理:先用 0.1 mol/L NaOH冲洗2 h，然后用超纯水冲洗至出口溶液pH中性，再用0.1 mol/L HCl冲洗0.5 h，然后用超纯水冲洗至出口溶液pH中性，再用甲醇冲洗1 h，置于气相色谱仪柱温箱中，60℃下用N2吹3 h，干燥。将10 mL γ-MAPS 与甲醇的混合溶液(1∶1，v/v)注入上述处理好的毛细管内，并将毛细管两端用橡胶塞封口，置于45℃反应16 h，然后用甲醇溶液冲洗1 h，40℃下用N2吹扫3 h，干燥。使毛细管内壁键合一层带烯基的硅烷化物质，两端封口备用。

1.2.2 整体柱的制备

将 400 μL 正丁醇、200 μL 1，4-丁二醇和 100 μL 水以及 200 μL EDMA(密度 1.051 g/mL，25℃)、200 mg SPE和4 mg AIBN混合均匀，超声振荡5 min后，将反应液注入已经预处理过的长度为50 cm的空毛细管中，控制吸入液的长度约25 cm(用于毛细管电泳实验)或者灌满已经预处理过的长度为30 cm毛细管(用于液相色谱实验)，将毛细管的两端用橡胶塞封口，置于气相色谱仪柱温箱中，按图1反应原理于60℃反应12 h。反应完成后，以甲醇为流动相，用液相色谱泵冲洗毛细管柱约4 h，然后注入纯乙腈，保存备用。

图1 反应原理示意图Fig.1 Scheme of reaction principle

1.3 毛细管柱色谱参数及色谱条件

毛细管整体柱的机械强度及重复性的评价在纳升液相色谱仪上进行，流动相为乙腈-水(95∶5，v/v)，流速为400 nL/min，紫外检测波长为224 nm。

毛细管整体柱性能评价使用毛细管电泳仪压力模式，流动相为不同配比的乙腈与10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 2.00)，分离压力为6.2×105Pa，进样压力和时间分别为6.9×104Pa和10 s。毛细管整体柱柱长为21 cm，出口端和检测窗口的距离为10.2 cm，紫外检测波长为214 nm。

2 结果与讨论

致孔剂的种类及与单体的配比、引发剂用量、聚合反应的温度、时间等多种因素都会影响聚合物整体柱床层及内部孔结构。

2.1 致孔剂和反应物种类、配比的优化

甲醇、正丙醇、正丁醇、1，4-丁二醇和水以及EDMA、SPE和AIBN按表1的比例混合均匀后反应，结果发现，只用甲醇作为致孔剂时聚合物床层十分致密，孔径小，通透性很差;用甲醇-正丙醇、甲醇-正丁醇时孔径有所增大，通透性明显改善，但柱效不高。考虑到SPE带有阳离子，尝试了极性稍强的正丁醇、1，4-丁二醇和水的三元体系混合致孔剂，发现所制备的毛细管整体柱不仅通透性好，而且样品分离效果好，理论塔板数可达5×104m－1以上。因此最后选定正丁醇、1，4-丁二醇和水(4∶2∶1，v/v/v)为致孔剂。此外，通过优化降低交联剂EDMA的比例，克服了毛细管整体柱弯曲时可能发生脆裂的现象，最终选择单体和交联剂质量比为49∶51。

在优化条件下制备整体柱，利用甲苯测得的死时间计算其渗透性(permeability，K):

其中u按以下公式计算:

式中 u、η、Fm、ΔP、L 和 r分别表示流动相的线速度、黏度、流速、毛细管实际柱压、柱长度和柱半径，具体数据为Fm=400 nL/min，η =0.35×10－3Pa·s(纯乙腈，25℃)，L=0.16 m，ΔP=2.2×106Pa。计算得到 K=2.17 ×10－14m2。

表1 SPE-co-EDMA聚合物整体柱的原料配比Table 1 Composition of the SPE-co-EDMA polymer monolithic columns

2.2 引发剂的用量

引发剂的用量影响聚合物反应的速度和孔径的大小。引发剂的用量过少(AIBN少于0.15 mg)时，聚合速度很慢，反应几乎不能进行;AIBN为1 mg时，聚合反应12 h后仍未进行完全;而引发剂用量过大，单体聚合速度快，最后形成的聚合物颗粒相对较小，聚合物孔径变小，通透性变差。经过优化，在实验中用4 mg AIBN引发聚合反应。

2.3 反应时间

反应时间对聚合物的骨架结构和孔径大小有重要影响，考察了反应时间为1、6、12、24 h时的聚合物性质。结果表明，1 h和6 h的反应不完全，聚合物骨架没有生成;12 h时聚合物反应完全，床层结构较好，孔径分布均匀;24 h时的聚合物性质与12 h的聚合物差别不大，因此选择反应时间为12 h。

2.4 反应温度

控制反应温度可以有效地控制聚合反应的进度。实验表明，反应温度为50℃时，时间长达24 h时聚合反应仍不发生;反应温度为60℃时，反应12 h可生成均匀的床层;反应温度为70℃时，反应12 h所得聚合物结构致密，通透性不好，因此选择反应温度为60℃。

2.5 毛细管整体柱性能评价

2.5.1 毛细管整体柱的表征

图2为SPE与EDMA在γ-MAPS预处理过的毛细管内聚合后横切面的扫描电镜图，可以清楚地看到经硅烷化处理的毛细管内壁与SPE-co-EDMA聚合物牢牢地结合在一起。聚合物孔径大小分布均匀，通透性较好。

2.5.2 毛细管整体柱的机械强度

分别在乙腈和纯水的条件下做了流速和压力的关系曲线，如图3所示，得到非常好的线性关系，表明该整体柱在10 MPa内具有良好的机械强度。

图2 SPE-co-EDMA毛细管整体柱截面的扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)images of poly(SPE-co-EDMA)capillary monolithic column

2.5.3 毛细管整体柱的重复性

在优化后的条件下合成了3批毛细管整体柱，每批3根，并在相同的液相色谱条件下考察其重复性。同一批次峰面积的柱间重复性(RSD)为1.0%;同一根柱峰面积的日间重复性(RSD)为1.2%;不同批次柱峰面积的重复性(RSD)为4.6%;可以看出所制备的毛细管整体柱的重复性良好。

2.5.4 色谱行为的考察及应用

图3 毛细管整体柱在乙腈和水中的柱压-流速曲线Fig.3 Curves of pressure versus flow rate in ACN and water of capillary monolithic column

图4 不同流动相下SPE-co-EDMA整体柱分离甲苯、硫脲、丙烯酰胺的色谱保留行为Fig.4 Chromatographic behaviors of acrylamide，thiourea and toluene on the SPE-co-EDMA monolithic column with different mobile phasesMobile phases:a.40%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);b.57%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);c.94%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00).Peaks:1.acrylamide;2.thiourea;3.toluene.

如图4所示，我们对甲苯、硫脲、丙烯酰胺3种化合物在SPE-co-EDMA聚合物整体柱上的保留行为进行了研究。流动相中乙腈含量不同，3种物质的出峰顺序也不同。乙腈含量较低时(40%)，硫脲比甲苯先出峰;随着乙腈含量的不断升高，硫脲的保留时间逐渐增长，甲苯保留时间逐渐缩短;乙腈含量较高时(94%)，甲苯最先出峰，硫脲最后出峰。这说明该毛细管整体柱是一种混合模式的整体柱，在乙腈含量较高时表现为亲水作用模式，在乙腈含量较低时又表现为反相色谱柱的特征［16］。

用5种混合标准品(甲苯、丙烯酰胺、胸腺嘧啶、尿嘧啶和硫脲)溶液对制备的毛细管整体柱进行了测试，得到很好的基线分离(见图5)。

图5 混合标准溶液在SPE-co-EDMA整体柱上的分离色谱图Fig.5 Chromatogram of a mixed solution of standards on the SPE-co-EDMA monolithic columnMobile phase:94% CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);UV:214 nm.Peaks:1.toluene;2.acrylamide;3.thymine;4.uracil;5.thiourea.

3 结论

本文制备了一种混合模式的SPE-co-EDMA毛细管整体柱。对反应物的配比、致孔剂的种类、引发剂用量、聚合反应温度及时间等制备条件进行了优化，使整体柱具有非常独特的分离特性，在乙腈含量较高时表现为亲水作用，在乙腈含量较低时表现为反相色谱分离模式。而且制备的整体柱具有良好的机械强度、渗透性和重复性，可在单根色谱柱上进行极性、非极性化合物的分离分析。此混合模式整体柱在单柱二维液相色谱方面将有很好的应用前景。

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