祝成亮，李 艳，刘兴晖，叶芳丽

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060；2.上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135；3.湖北医药学院附属东风医院检验科，湖北 十堰 442008)

丙型肝炎病毒对白细胞介素32表达影响的研究

祝成亮1，李 艳1，刘兴晖2，3，叶芳丽1

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060；2.上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135；3.湖北医药学院附属东风医院检验科，湖北 十堰 442008)

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)在体内外对白细胞介素32(IL-32)表达的影响。方法 荧光定量PCR和免疫印迹法检测Huh7.5.1细胞中IL-32 mRNA和蛋白的表达水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-32的血清含量。结果 HCV感染的Huh7.5.1细胞IL-32 mRNA和蛋白的表达水平较对照细胞高，HCV患者IL-32血清含量明显高于健康对照(P＜0.05)。结论 HCV能够在体内外促进IL-32的合成和分泌。

丙型肝炎病毒；白细胞介素32；酶联免疫吸附试验；表达

据世界卫生组织调查，目前全球有大约1.7亿的人感染丙型肝炎病毒(HCV)，约有20%的HCV患者会在20年内发展成为肝硬化，一旦肝硬化形成，发展成为肝癌的进程为每年1%～4%，HCV肝损伤并非由病毒本身直接导致，而是由于病毒与机体免疫系统相互作用过程中导致正常肝组织产生纤维样变引起。白细胞介素32(IL-32)是一种重要的炎症因子，参与机体的炎症反应。本研究主要通过体内外实验探讨HCV对IL-32表达的调节，为揭示HCV的致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集HCV感染的患者138例，其中男性75例，女性63例，平均年龄(45.3±13.4)岁，所有患者均排除其他肝病毒和细菌的感染。选取126例健康体检者作为对照，其中男性67例，女性59例，平均年龄(42.7±12.5)岁。

1.2 材料 人肝癌细胞系Huh7.5.1及含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞由本室保存[1]；IL-32 ELISA检测试剂盒购自美国Rapidbio公司；IL-32多克隆抗体购自购自美国美国Abcam公司；TRIzol R试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录酶M-MLV购自美国Promega公司，荧光定量PCR采用美国LC480 PCR仪。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 Huh7.5.1细胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，在37℃恒温箱中进行培养。

1.3.2 荧光定量PCR检测 TRIzol R试剂提取Huh7.5.1细胞的RNA，逆转录成cDNA后，用IL-32基因的检测引物5'-GAGACAGTGGCGGCTTAT-3' (上游)，5'-TCCTCAACATCCGGGACA-3'(下游)进行荧光定量PCR扩增，以β-actin为内参照。

1.3.3 Western blot检测 裂解液裂解Huh7.5.1细胞，取30µg蛋白样品加入上样缓冲液后进行SDS-PAGE电泳分离,电泳结束后将蛋白转到硝酸纤维素(NC)膜上，分别加入IL-32蛋白多克隆抗体和二抗，最后采用电化学发光(ECL)进行显色。

1.3.4 EIISA的检测 IL-32血清含量采用ELISA法进行检测，方法参照试剂盒说明书。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示，HCV感染组和对照组IL-32血清含量的比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCV患者IL-32血清水平升高 我们收集了138例HCV患者和126例健康体检者血清，采用ELISA检测了IL-32的水平。结果显示，HCV患者血清IL-32水平[(162.54±43.78)pg/ml]显著的高于健康体检者水平[(98.59±37.36)pg/ml，P＜0.05]。

2.2 HCV在细胞水平上调IL-32 mRNA和蛋白的表达 为探讨HCV在细胞水平对IL-32表达的影响，我们采用荧光定量PCR和Western blot检测了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其对照细胞IL-32 mRNA和蛋白的表达情况。结果显示，感染了HCV的Huh 7.5.1细胞IL-32 mRNA和蛋白的表达明显升高。见图1和图2。

图1 荧光定量PCR检测IL-32 mRNA的表达

图2 Western blot检测IL-32蛋白的表达

3 讨论

丙型肝炎病毒(HCV)是一种属于黄病毒科家族的带有包膜的RNA病毒，它包含一条长为9 600个碱基的正义单链RNA基因组。HCV感染能够引起机体的炎症反应，导致急慢性肝炎，最终发展为原发性肝癌(HCC)，HCV感染是HCC发生的主要原因之一。

白细胞介素32(IL-32)是一种新发现的细胞因子，参与机体的炎症反应，其基因定位于16号染色体上，含有8个小外显子，主要由免疫细胞表达，但在一些炎症部位的组织中也有表达[2]。研究证实艾滋病患者和流感患者血清中IL-32的表达升高[3]，在乙型肝炎的研究中也发现，乙肝患者IL-32的血清水平也明显升高[4]。

在本研究中，我们通过ELISA的方法检测了HCV患者和健康对照者血清含量，结果发现HCV患者IL-32血清含量明显高于健康对照，表明HCV能够在体外上调IL-32的表达。目前一般认为HCV并非直接损伤肝细胞，而是由于机体炎症反应所引起。HCV感染机体后导致一系列细胞因子表达的升高，包括白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)等[4]。IL-32能够诱导很多炎症因子如白细胞介素1β(IL-1β)，IL-6，白细胞介素8(IL-8)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等的表达，进而引起机体的炎症反应[5]。因此，HCV可能通过上调IL-32的表达来参与肝炎的发生和发展。

由于HCV主要感染肝细胞，我们采用荧光定量PCR和Western blot检测了HCV病毒感染的肝癌细胞Huh7.5.1及其对照细胞IL-32表达的差异，发现HCV能够在体内促进IL-32的表达。研究证实流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)通过激活CREB和NF-κ B通路诱导IL-32的转录[2，6]，但HCV通过何种信号通路调节IL-32的表达，是否也通过激活CREB和NF-κ B通路进行调节，尚待进一步研究。

[1]祝成亮,李 艳,叶芳丽,等.丙型肝炎病毒上调胶原三股螺旋重复蛋白1的表达[J].海南医学,2013,24(17):2497-2498.

[2]Li W,Liu Y,Mukhtar MM,et al.Activation of interleukin-32 pro-inflammatory pathway in response to influenza A virus infection[J]. PLoS One,2008,3(4):e1985.

[3]Xu Q,Pan X,Shu X,et al.Increased interleukin-32 expression in chronic hepatitis B virus-infected liver[J].

[4]Jung MY,Son MH,Kim SH,et al.IL-32 gamma induces the maturation of dendritic cells with Th1-and Th17-polarizing ability through enhanced IL-12 and IL-6 production[J].J Immunol,2011, 186(12):6848-6859.

[5]Nold-Petry CA,Nold MF,Zepp JA,et al.IL-32-dependent effects of IL-1beta on endothelial cell functions[J].Proc Natl Acad Sci U SA,106(10):3883-3888.

[6]Pan X,Cao H,Lu J,et al.Interleukin-32 expression induced by hepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB [J].Mol Immunol,2011,48(12-13):1573-1577.

Study on the effect of Hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1, LIU Xing-hui2,3,Ye Fang-lil.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,of Wuhan Universety,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital,Shanghai, 200135,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442008,Hubei,CHINA

Objective To explore the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32 (IL-32).Methods The mRNA and protein expression of IL-32 in Huh7.5.1 cells were measured by real-time PCR and western blot.Serum levels of IL-32 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Expression of IL-32 mRNA and protein was higher in Huh7.5.1 cells infected by HCV than in the control cells.Serum IL-32 levels was significantly higher in HCV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Conclusion HCV can upregulate the synthesis and secretion of IL-32 both in vivo and in vitro.

Hepatitis C virus;Interleukin 32;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2014）18—2708—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1062

2014-03-31)

国家临床重点专科专项经费(编号：2010305)；国家自然科学基金(编号：81101485)；湖北省教育厅科学技术研究项目(编号：D20122404)

李 艳。E-mail：yanlitf1120@163.com