刘 艳，曾今诚，梁小泉

(1.佛山市南海区人民医院耳鼻咽喉科，广东 佛山 528200；2.广东医学院检验医学研究所，广东 湛江 524023)

鼻咽癌组织EBI3和p35蛋白的表达及临床意义

刘 艳1，曾今诚2，梁小泉1

(1.佛山市南海区人民医院耳鼻咽喉科，广东 佛山 528200；2.广东医学院检验医学研究所，广东 湛江 524023)

目的 检测EBI3、p35在鼻咽癌(NPC)组织中的表达水平，分析EBI3和p35在NPC发生发展中的作用及临床意义。方法 应用免疫组织化学方法检测50例NPC患者、30例癌旁黏膜和25例鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中EBI3和p35表达，并分析其与NPC患者临床分期、病理组织类型和淋巴结转移的关系。结果 NPC组织中EBI3高表达率为62.0%，显著高于癌旁黏膜组织中的36.7%(χ2=4.83，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%(χ2=4.53，P＜0.05)。T3～T4期NPC患者中EBI3高表达率显著高于T1～T2期患者(χ2=17.24，P＜0.01)；非角化型鳞癌NPC患者癌组织中EBI3高表达率显著高于角化型鳞癌患者(χ2=8.78，P＜0.01)；有颈部淋巴结转移NPC患者癌组织中EBI3高表达率显著高于无颈部淋巴结转移癌患者(χ2=14.49，P＜0.01)。p35高表达率为60.0%，显著高于癌旁黏膜组织中的33.3%(χ2=5.33，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%(χ2= 3.85，P＜0.05)。T3～T4期NPC患者中p35高表达率显著高于T1～T2期患者(χ2=19.28，P＜0.01)；非角化型鳞癌NPC患者癌组织中p35高表达率显著高于角化型鳞癌患者(χ2=7.24，P＜0.01)；有颈部淋巴结转移NPC患者癌组织中p35高表达率显著高于无颈部淋巴结转移癌患者(χ2=5.56，P＜0.05)。NPC组织中EBI3和p35表达之间呈正相关(r=0.328，P＜0.05)。结论 NPC组织中EBI3和p35高表达与鼻咽癌发生、发展相关，有望作为患者预后判断的重要标志物。

鼻咽癌；EBI3；p35；IL-35；免疫组织化学

EBI3是IL-12家族成员IL-27和IL-35的组成亚基，属于可溶型细胞因子受体样亚单位。p35却是IL-12家族成员IL-12和IL-35的组成亚基，是一个单体4-折叠螺旋束样细胞因子亚单位。IL-12和IL-27均在肿瘤免疫及炎症反应中具有重要作用[1，2]。IL-35作为2007年新发现的一种抗炎症细胞因子，其在肿瘤免疫中的作用还不清楚[3-4]。基因表达谱分析显示，IL-35具有广泛的组织分布[5]。研究显示胎盘滋养层细胞EBI3和p35基因均高表达，且在人类足月正常胎盘滋养细胞中EBI3表达与p35表达相关[6]。近来研究报道，EBI3和p35均表达于人类的大B细胞淋巴瘤，黑色素瘤，结肠癌以及多种肿瘤细胞株[7]。本研究我们采用免疫组织化学方法检测EBI3和p35在鼻咽癌(NPC)、癌旁黏膜和鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达情况，探讨EBI3和p35在鼻咽癌发生、发展中的作用及相互关系，为揭示IL-35在肿瘤免疫中的作用提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年3月至2013年4月广东医学院附属医院和佛山市南海区人民医院耳鼻喉科，经病理科确诊的50例NPC新鲜组织标本、30例同期的癌旁黏膜组织和25例鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织置于液氮罐保存备用。根据WHO肿瘤组织学分型(1991)标准，50例NPC组织中21例为角化型鳞状细胞癌，29例为非角化型鳞状细胞癌，其中30例NPC患者发生颈部淋巴结转移者，20例未发生颈部淋巴结转移者。根据国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制定的TNM分期法，将NPC病例分为：T1期10例、T2期16留、T3期19例和T4期5例。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 试剂与方法 兔抗人EBI3抗体、兔抗人p35抗体购自Santa Cruz公司；EBI3和p35抗体都按1:300稀释，免疫组织化学Power Vision试剂盒和DAS显色剂均购自北京中杉生物技术公司。免疫组织化学实验步骤严格按试剂盒说明书进行，已知阳性结肠癌标本作阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。EBI3、p35染色阳性呈棕黄色，均表达于细胞浆和细胞膜，每张切片在40倍显微镜下顺序找1000个细胞，计算出阳性细胞的百分数及染色强度。对阳性细胞所占的百分数计分，＜5%=0，5%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，＞75=4。根据染色强度，无色=0，淡黄色=1，棕黄色=2，深棕色=3进行评分，累积0分为“-”，1～2分为“+”，3～4分为“++”，5～ 7分为“+++”。将“-～+”视为蛋白低表达，“++～+++”视为蛋白高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0统计学软件进行统计分析，率的比较行χ2检验，鼻咽癌组织EBI3和p35表达的相关性分析采用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EBI3和p35在鼻咽组织中的表达 EBI3阳性染色定位于细胞浆或细胞膜。NPC组织中EBI3高表达率为62.0%(31/50)，显著高于癌旁黏膜组织中的36.7%(11/30)(χ2=4.83，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%(9/25)(χ2=4.53，P＜0.05)，差异有统计学意义。癌旁黏膜组织和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中EBI3高表达率差异无统计学意义(χ2=0.001，P＞0.05)。p35阳性染色主要定位于细胞浆或细胞膜。NPC组织中p35高表达率为60.0%(30/50)，显著高于癌旁黏膜组织中的33.3% (10/30)(χ2=5.33，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%(9/25)(χ2=3.85，P＜0.05)，差异有统计学意义。癌旁黏膜组织和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中p35高表达率差异无统计学意义(χ2=0.04，P＞0.05)。

2.2 EBI3、p35与鼻咽癌临床病理特征的关系 EBI3、p35的表达程度均与鼻咽癌临床分期、组织学分型和颈部淋巴结转移相关，与鼻咽癌患者的发病年龄及性别无关，见表1。T3～T4期NPC患者中EBI3高表达率及p35高表达率显著高于T1～T2期患者；非角化型鳞癌NPC患者癌组织中EBI3高表达率及p35高表达率显著高于角化型鳞癌患者；有颈部淋巴结转移NPC患者癌组织中EBI3高表达率及p35高表达率显著高于无颈部淋巴结转移癌患者。

表1 EBI3、p35蛋白表达与临床病理特征关系

2.3 EBI3和p35的相关性 经Pearson相关分析显示，NPC组织中EBI3和p35表达之间呈正相关(r=0.328，P＜0.05)。

3 讨论

目前已有大量研究证实IL-35与多种肿瘤的发生发展相关。近年来，研究人员发现前列腺癌患者自发产生一种抗原特异的中有一群特异的分泌IL-35的CD8+CTLA-4+T细胞亚群，该亚群在免疫接种过程中，以IL-35依赖的方式阻止肿瘤抗原特异性反应[8]。Wang等[9]初步研究大B细胞淋巴瘤，鼻咽癌，黑色素瘤组织均能产生IL-35，且他们在对黑色素瘤的研究发现IL-35通过增强骨髓细胞的积累、肿瘤血管生成、抑制肿瘤的免疫力促进肿瘤生长。Long等[10]发现多种癌细胞株(A549，SW480，BEL-7402，HepG2，SiHa，HPAC，MDA-MB-231，MCF-7)中存在IL-35亚基表达，且TNF-α和IFN-C刺激能导致IL-35的表达增加，过度表达的IL-35抑制在体外肿瘤细胞生长，诱导细胞周期停滞在G1期，并介导血清饥饿诱导的细胞凋亡。

笔者在50例NPC患者癌组织中发现IL-35亚基EBI3和p35表达强度显著高于癌旁组织及鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织(P均＜0.05)，说明EBI3和p35表达与NPC发病有关，并提示IL-35与NPC发生、发展及恶变中具有重要作用，特别是NPC患者癌组织中EBI3和p35的表达程度与鼻咽癌临床分期、组织学分型和颈部淋巴结转移也密切相关。此外，NPC组织中EBI3和p35表达之间呈显著正相关(r=0.328，P＜0.05)。这些研究进一步说明IL-35在鼻咽癌免疫逃逸中具有重要作用，但其确切机制还有待进一步深入研究。

[1]Del Vecchio M,Bajetta E,Canova S,et al.Interleukin-1:Biological properties and clinical application[J].Clin Cancer Res,2007,13 (16):4677-4685.

[2]Ho MY,Leu SJ,Sun GH,et al.IL-27 derectly restrains lung tumorigenicity by suppressing cyclooxygenase-2-mediated activities[J].J Immunol,2009,183(10):6217-6226.

[3]Chaput N,Louafi S,Bardier A,et al.Identification of CD8+CD25+Foxp3+suppressive T cells in colorectal cancer tissue[J].Gut,2009, 58(4):520-529.

[4]Lau KM,Cheng SH,Lo KW,et al.Increase in circulating Foxp3+ CD4+CD25(high)regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients[J].Br J Cancer,2007,96(4):617-22.

[5]Li X,Mai J,Virtue A,et al.IL-35 is a novel responsive anti-inflammatory cytokine—a new system of categorizing anti-inflammatory cytokines[J].PLoS One,2012,7(3):e33628.

[6]Devergne O,Coulomb-L'Herminé A,Capel F,et al.Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3,an interleukin-12 p40-related molecule,throughout human pregnancy:involvement of syncytiotrophoblasts and extravillous trophoblasts[J].Am J Pathol,2001, 159(5):1763-1776.

[7]Long J,Zhang X,Wen M,et al.IL-35 over-expression increases apoptosis sensitivity and suppresses cell growth in human cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(1):364-369.

[8]Olson BM,Jankowska-Gan E,Becker JT,et al.Human prostate tumor antigen-specific CD8+regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade[J].The Journal of Immunology,2012, 189:5590-5601.

[9]Wang Z,Liu JQ,Liu Z,et al.Tumor-derived IL-35 promotes tumor growth by enhancing myeloid cell accumulation and angiogenesis [J].J Immunol,2013,190(5):2415-2423.

[10]Long J,Zhang X,Wen M,et al.IL-35 over-expression increases apoptosis sensitivity and suppresses cell growth in human cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(1):364-369.

Expression and clinical significance of EBI3 and p35 in nasopharygeal carcinoma.

LIU Yan1,ZENG Jin-cheng2, LIANG Xiao-quan1.1.Department of Otorhinlaryngology,Naihai People's Hospital,Foshan 528200,Guangdong, CHINA;2.Institute of Laboratory Medicine of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong,CHINA

Objective To detect the expression of EBI3 and p35 in nasopharyngeal carcinoma(NPC)and to analyze the clinical significance of them in NPC patients.Methods Immunohistochemistry was used to detect 50 cases of NPC patients,30 cases of adjacent mucosa tissues and 25 cases of nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory patients.The relationship of EBI3 or p35 with clinical stage,pathological type and lymph node metastasis were also analyzed on 50 cases of NPC patients.Results The high expression rates of EBI3 in NPC patients was significantly higher than those in adjacent mucosa(62.0%to 36.7%,χ2=4.83,P＜0.05)and nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory tissue(62.0%to 36.0%,χ2=4.53,P＜0.05).The high expression rates of EBI3 in stage T3～T4NPC patients were significantly higher than those in stage T1～T2NPC patients(χ2=17.24,P＜0.01).The high expression rates of EBI3 in non-keratinizing squamous carcinoma patients was significantly higher than those in keratinizing squamous carcinoma patients(χ2=8.78,P＜0.01),and in NPC patients having a cervical lymph node metastasis than those without lymph node metastasis(χ2=14.49,P＜0.01).In NPC patients cancer tissues,we also found the high expression rates of p35 were significantly higher than those in adjacent mucosa(60.0%to 33.3%,χ2=5.3,P＜0.05)and nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory tissue(60.0%to 36.0%,χ2=3.85,P＜0.05).The high expression rates of p35 on stage T3～T4NPC patients were significantly higher than those on stage T1～T2NPC patients(χ2=19.28,P＜0.01),in non-keratinizing squamous carcinoma patients than those in keratinizing squamous carcinoma patients(χ2=7.24,P＜0.01),and in NPC patients having a cervical lymph node metastasis than those without lymph node metastasis(χ2=5.56,P＜0.05).The expression of EBI3 in NPC patients was positively related to the expression of p35(r=0.328,P＜0.05). Conclusion The high expression of EBI3 and p35 in NPC patients may relevant to tumor pathogenesis and progression,and maybe an important marker for NPC prognosis.

Nasopharygeal carcinoma;EBI3;p35;IL-35;Immunohistochemistry

R739.63

A

1003—6350（2014）18—2670—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1048

2014-03-16)

佛山市医学类科技攻关项目(编号：201308188)

刘 艳。E-mail：liuyan123119@sina.com