尚英彬　王展　陈芳园　庞莹　席鹏　任秋实

[摘要]目的：本研究拟定量地比较Q开关和长脉宽1064 nm掺钕：钇-铝石榴石（neodymium-yttrium-aluminum garnet， Nd：YAG）激光诱导真皮胶原重建的疗效。方法：应用Q开关和长脉宽1064 nm Nd：YAG激光分别对36只雌性昆明小鼠左侧后背皮肤进行连续4次治疗，每次间隔1周，右侧相应的部位作为自身对照。分别于第1次治疗后1h、1天、7天、21天、30天和60天对小鼠皮肤行活组织取材。应用免疫组化方法分别对皮肤组织样品中真皮I、III型胶原进行检测，染色结果应用Motic医学数字图像分析系统进行定量分析。结果：与正常对照组相比，Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗后7天、21天、30天和60天，真皮I型胶原及III型胶原水平明显增高（均P<0.01）。长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗后21天、30天和60天，真皮I型胶原水平明显增高（均P<0.01）；激光治疗后7天、21天、30天和60天，真皮III型胶原水平明显增高（分别为P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01）。两组激光的比较：激光治疗后7天、21天和30天，Q开关1064nm Nd：YAG激光治疗组真皮I型胶原水平较长脉宽1064nm Nd：YAG激光治疗组明显增高（均P<0.01），而激光治疗后60天明显降低（P<0.05）；激光治疗后7天和21天，Q开关1064nm Nd：YAG激光治疗组较长脉宽1064nm Nd：YAG激光治疗组真皮III型胶原水平明显增高（分别为P<0.05、P<0.01）。结论：Q开关和长脉宽1064nm Nd：YAG激光均可引起真皮胶原重建，但二者的作用效果不尽相同。

[关键词]非剥脱性激光嫩肤；胶原重建；Nd：YAG激光

[中图分类号]R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）02-0121-04

Q开关1064 nm Nd：YAG激光和长脉宽1064 nm Nd：YAG激光是目前临床上较常用的两种非剥脱性嫩肤技术，二者波长相同，属于发射近红外光波长的激光，但因脉宽不同，与皮肤组织的相互作用方式不同。Q开关1064 nm Nd：YAG激光主要是对皮肤组织产生光机械作用诱导真皮胶原重建而嫩肤 [1-2]，而长脉宽1064 nm Nd：YAG激光主要是通过光热效应达到嫩肤的目的[1，3]。

迄今为止，缺乏系统性的对Q开关1064 nm Nd：YAG激光和长脉宽1064 nm Nd：YAG激光诱导真皮胶原重建疗效的比较性研究，本研究以雌性昆明小鼠作为实验动物模型，利用免疫组化方法和计算机图像分析系统定量地评价和比较Q开关和长脉宽1064 nm Nd：YAG激光诱导真皮胶原重建的疗效，以揭示二者引起胶原重建的特点，为指导临床实践提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物：雌性昆明小鼠36只，8～10周龄，体重约30g， 由复旦大学上海医学院实验动物中心提供，按取材时间点不同随机分6组，每组6只。

1.2 激光照射：参照文献[1-2，4]，实验前24h将小鼠背部皮肤应用市售脱毛膏行脱毛处理，然后于10%水合氯醛1ml/kg腹腔内注射麻醉下行激光照射治疗，治疗参数如表1，分别对小鼠左侧背部上下部位行Q开关1064 nm Nd：YAG激光和长脉宽1064nm Nd：YAG激光治疗，右侧相应的部位作为自身对照，照射激光的光斑有10%重叠，每个部位重复照射3遍，共连续治疗4次，每次之间间隔1周。第1次激光照射后1h、1天、7天、21天、30天和60天分别对小鼠皮肤进行活组织取材，其中第3次和第4次取材是在相应的治疗前，皮肤组织取下后立即放入10%福尔马林中固定。

1.3 免疫组化实验：应用链酶亲和素-生物素-酶复合物（StreptAvidin-Biotin-enzyme Complex， SABC）染色试剂盒（博士德生物工程有限公司，武汉），一抗为兔抗小鼠I、III型胶原多克隆IgG抗体（博士德生物工程有限公司，武汉），实验步骤按说明书操作。实验结果应用Motic医学数字图像分析系统对二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride， DAB）阳性染色的切片进行定量分析。400×下随机选取3个视野，分别计算小鼠真皮I、III型胶原阳性表达面积和统计场总面积的百分比，取平均值。

1.4 统计学处理：所测的数据以均数±标准差（±s）表示，应用SPSS15.0软件对数据进行单因素方差分析（analysis of variance， ANOVA），P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 真皮I型胶原免疫组化染色结果：见图1，Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗后7天时开始明显升高，30天时达高峰，60天时较30天时有所下降。长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗后21天时开始明显升高，60天时达高峰。与正常对照组相比，Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗组于治疗后7天、21天、30天和60天明显增高，差异有统计学意义（均P<0.01），长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗组于治疗后21天、30天和60天明显增高，差异有统计学意义（均P<0.01）。两组激光比较：Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗组于治疗后7天、21天和30天较长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗组明显增高，差异有统计学意义（分别为P<0.01，P<0.01，P<0.01），于治疗后60天较长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 真皮III型胶原免疫组化染色结果：见图2，Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗后7天后始明显升高， 21天达到高峰，之后逐渐降低。长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗后7天开始明显升高，30天时达到高峰，60天时较30天有所降低。与正常对照组相比，Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗组于激光治疗后7天、21天、30天和60天明显增高，差异有统计学意义（均P<0.01）；长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗组于治疗后7天、21天、30天和60天明显增高，差异有统计学意义（分别为P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01）。两组激光比较：Q开关1064 nm Nd：YAG激光治疗组于治疗后7天和21天较长脉宽1064 nm Nd：YAG激光治疗组明显增高，差异有统计学意义（分别为P<0.05，P<0.01）。

3 讨论

皮肤光老化的各种治疗方法中，非剥脱性嫩肤技术因疗效确切、副作用小等特点具有明显的优势[5-6]。正常真皮组织的细胞外基质主要有I型胶原构成，还有一小部分III型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和纤维粘连蛋白[7]。皮肤光老化的组织学改变主要表现为真皮胶原退行性变，排列紊乱，I型和III型胶原水平下降。 因此非损伤性激光嫩肤疗效的评价多是通过组织学水平检测真皮胶原水平的变化来实现的。

本研究通过免疫组化实验方法，对经连续4次激光治疗的小鼠真皮I型和III型胶原进行染色，结合计算机图像分析系统，定量地检测和比较了Q开关1064nm Nd：YAG激光和长脉宽1064nm Nd：YAG激光的疗效。通过对不同时间检测点小鼠真皮I型和III型胶原水平的动态研究发现Q开关1064nm Nd：YAG激光和长脉宽1064nm Nd：YAG激光均可引起真皮胶原重建，既可诱导I型胶原增多，又可诱导III型胶原增多。其中Q开关1064nm Nd：YAG激光引起胶原重建起效早且作用强，但长脉宽1064 nm Nd：YAG激光具有良好的远期疗效。根据我们的实验结果，临床上进行非剥脱性嫩肤治疗时，将Q开关和长脉宽1064nm Nd：YAG激光联合应用，治疗早期即可较快地引起新生胶原增多，快速地改善皮肤光老化的临床症状，又可保证胶原重建疗效的持久性，从而获得理想的嫩肤效果。

目前激光引起真皮胶原重建的机制还不明了，多数学者认为是激光作用于皮肤诱导了真皮的可控性损伤，启动了皮肤的创伤修复反应，从而导致真皮成纤维细胞增生和胶原重建[8-10]。Q开关1064nm Nd：YAG激光和长脉宽1064nm Nd：YAG激光二者虽然波长相同，但与皮肤组织的作用方式不同，Q开关1064 nm Nd：YAG激光，应用调Q技术，脉宽极短，达纳秒级，限制热损伤局限于靶部位，减少热量向周围组织弥散。亚细胞结构如黑素小体等吸收激光能量后在极短的时间内来不及发生热传导，受热急剧膨胀，产生冲击波作用于周围真皮组织，因此Q开关1064nm Nd：YAG激光主要是对皮肤组织产生光机械作用达到嫩肤的目的[1-2]。而长脉宽1064nm Nd：YAG激光脉宽较长，达毫秒级，其中0.3ms脉宽可被真皮内微血管中的氧合血红蛋白累积性吸收，热量向周围弥散，逐渐加热周围乳头层和网状层真皮，因此该激光主要是对靶组织产生光热效应，进而通过后续反应达到嫩肤的目的[1，3]。本研究中结果证实无论是光机械作用还是光热作用均可引起真皮胶原重建，但由于二者与皮肤组织的相互作用方式不同，机械性损伤和热损伤引起的修复反应方式不完全相同，从而引起真皮胶原重建的效果不尽相同。两种损伤是如何引起皮肤创伤修复反应的启动目前还不清楚，其确切的作用机制仍有待进一步探讨。

[参考文献]

[1]Liu H，Dang Y，Wang Z，et al. Laser induced collagen remodeling： a comparative study in vivo on mouse model[J].Lasers Surg Med，2008，40（1）：13-19.

[2]Dang YY，Ren QS，Liu HX，et al.Comparison of histologic， biochemical， and mechanical properties of murine skin treated with the 1064-nm and 1320-nm Nd：YAG lasers[J].Exp Dermatol， 2005，14（12）：876-882.

[3] Lipper GM， Perez M. Nonablative acne scar reduction after a series of treatments with a short-pulsed 1，064-nm neodymium：YAG laser[J].Dermatol Surg， 2006，32（8）：998-1006.

[4]尚英彬，王展，庞莹，等.肥大细胞在长脉宽1064nm Nd：YAG激光非剥脱性嫩肤中的作用[J].中国美容医学，2010，19（5）：697-700.

[5]霍孟华.非剥脱性嫩肤技术治疗皮肤老化[J].中国美容医学，2007，16（10）：1440-1444.

[6]Hirsch RJ，Dayan SH.Nonablative resurfacing[J].Facial Plast Surg，2004，20（1）：57-61.

[7]Fisher GJ，Wang ZQ，Datta SC，et al. Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light[J].N Engl J Med， 1997，337（20）：1419-1428.

[8]Capon A，Mordon S. Can thermal lasers promote skin wound healing[J]？ Am J Clin Dermatol，2003，4（1）：1-12.

[9]Ross EV， Zelickson BD. Biophysics of nonablative dermal remodeling[J].Semin Cutan Med Surg，2002，21（4）：251-265.

[10]Sadick NS. Update on non-ablative light therapy for rejuvenation： a review[J].Lasers Surg Med，2003，32（2）：120-128.

[收稿日期]2013-11-14 [修回日期]2013-12-09

编辑/张惠娟