陈鸿鹏　朱凤云　谢耀坚

摘 要 微管蛋白是真核生物中普遍存在的结构蛋白，在细胞的形态维持、分裂、迁移以及信号转导等方面发挥着重要的作用，同时也是荧光定量PCR技术中常见的一种内参基因。为深入了解α-微管蛋白（α-tubulin）对桉树生长发育的调节，本研究根据α-Tubulin基因的保守区段设计简并引物，从赤桉嫩叶中获得了3条tubulin基因的片段，并利用RACE技术得到了这些基因的全长cDNA，将其命名为EC-TUB1、EC-TUB2和EC-TUB3基因。此外，通过网上资源和生物信息学软件对这3条基因进行分析，发现这些基因编码的蛋白具有α-Tubulin蛋白特有的保守序列和活性结构域的相关特征，同时与其他植物的α-Tubulin蛋白具有较高的相似性，这为了解α-tubulin在桉树生长发育过程中的表达特性以及α-tubulin蛋白的功能，进一步揭示和利用桉树生长发育机理和树种间的差异性奠定了理论基础。

关键词 赤桉；α-tubulin；家族基因；克隆；生物信息学分析

中图分类号 Q753；S722.33 文献标识码 A

微管蛋白（Tubulin，TUB）最初是在精子鞭毛中发现的一种细胞骨架蛋白，是微管的主要化学成分，可以分为α、β、γ、δ、ε等多种微管蛋白，其中，α、β和γ是主要的微管蛋白[1-4]。α和β微管蛋白属于球形蛋白，是构成微管的基本组成单位。α/β微管蛋白的二聚体与GTP结合后，分布于微管的两端，β微管蛋白在头部，α微管蛋白在尾部。此外，α微管蛋白在人类神经元的形成中起着重要的作用[5]，同时对于植物抵抗外界真菌侵入有一定作用[6]。研究表明，α微管蛋白基因在玉米败育前的相对表达量大于败育后的相对转录量，转录量证明了α微管蛋白在花粉发育中起着重要作用，对玉米的雄性不育性密切相关[7]。β微管蛋白在动物中神经信号的传导和植物中的信号传递起着重要的作用[8]。李园莉等研究发现，棉花的TUB基因主要在纤维细胞中表达，在细胞快速延伸阶段表达量较高，在伸长速度最快时达到了高峰，并在酵母中大量的表达能使其细胞显著伸长或产生分支，暗示该基因的表达可能与纤维细胞的极性生长相关[9]。由于α微管蛋白和β微管蛋白的广泛分布，其编码基因还是常见的内参基因，在实时荧光定量PCR技术中有着广泛的应用[10]。γ微管蛋白在真核生物体内行使着重要的细胞功能，它起始于胞内微管的晶核形成，控制着有丝分裂中纺锤体的复制等，并进而影响微管以及其他细胞结构的生物功能[11-12]，同时也对α/β微管蛋白形成微管具有一定的调控作用[13]。

赤桉（Eucalyptus camaldulensis）是桉树（Eucalypts）属桃金娘科（Myrtaceae）的一个树种，具有生长快，适应性强，喜光，耐高温、干旱、耐碱等特性，因此在桉树的育种与栽培等领域中有着广泛的应用[14-15]。微管蛋白作为细胞骨架蛋白，对植物的生长极为重要。因此，为了了解微管蛋白基因的特点对赤桉的生长影响，本研究采用RACE和RT-PCR方法克隆了赤桉中的α-tubulin家族的3条基因，并利用生物信息学方法对这些基因进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的赤桉幼苗栽种于国家林业局桉树研究开发中心国家南方种苗基地，将赤桉的嫩叶采摘后，立即于液氮中保存备用。

1.1.2 主要试剂 感受态细胞为大肠杆菌DH5α、dNTPs、DNase、DNA凝胶回收试剂盒等购自Ambio公司；cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司；Prime-star高保真酶购自Takara公司； 100 bp plus DNA Ladder、DNase、Total RNA Purification System、5′RACE以及3′RACE试剂盒等购自Invitrogen公司；pEASY-Blunt Simple载体购自北京全式金公司；其它生化试剂和常规试剂如DEPC、H2O、Tris、EDTA、无水乙醇、EB、巯基乙醇等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 生物信息学软件以及网上资源 GENDOC、Chromas、Vector NI 11.0、GeneTree、Anthprot 5.0、VMD 1.8.5以及Primer Premier 5.0等生物信息学软件，GenBank，SoftBerry，ExPASy-ProtParam tool以及Swissmodel等网上资源。

1.2 方法

1.2.1 赤桉叶片总RNA提取与cDNA合成 将液氮保存的赤桉嫩叶迅速取出，在液氮中研磨成粉末状，参照Invitrogen公司提供的试剂盒进行总RNA的提取，电泳检测，之后用相应的试剂盒将总RNA反转录成cDNA、5′RACE cDNA和3′RACE cDNA，保存于-20 ℃备用。

1.2.2 TUB基因保守区片段的克隆 TUB蛋白是一种在进化上比较保守的蛋白，尤其是功能性区域，通过对NCBI数据库中TUB蛋白的序列分析和比对，发现TUB蛋白最保守区的序列为：DKTV

GGGDDAFNTFFSETGAGKHVPRA，SMMAKCDPRH

GKYMACCLMYRGDVVPKDVNAAV，由此设计了如下引物进行保守区的扩增：

EC-TUB F1：5′-GATAAAACCGTGGGCGGCG

GCGATGA-3′

EC-TUB R1：5′-CGTTCACATCTTTCGGCACC

ACA-3′

以赤桉嫩叶cDNA为模板，选用EC-TUB F1& EC-TUB R1引物进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系：0.5 μL PrimeStar聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×PCR buffer（with Mg2+），4.0 μL dNTPs（各2.5 mmol/L），2.0 μL cDNA，1.0 μL EC-TUB F1 （10 μmol/L），1.0 μL EC-TUB R1（10 μmol/L），31.5 μL ddH2O。PCR扩增条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃继续延伸5 min；4 ℃保温。反应结束后，对产物进行回收、克隆和测序。

1.2.3 TUB基因RACE片段的克隆 通过对获得基因片段进行克隆测序，利用Primer Premier 6.0分别设计了EC-TUB基因的5′RACE和3′RACE引物（表1），由生物公司合成并通过PAGE方式进行纯化。

同理，以赤桉嫩叶5′RACE cDNA为模板，选用5′RACE引物与UPM为引物进行巢式PCR扩增，反应体系同上，用UPM& 5GSP 1/4/7代替EC-TUB F1& EC-TUB R1进行扩增。此后继续用5GSP 2/5/8和5GSP 3/6/9做巢式PCR以提高产物纯度。

3′RACE反应与5′RACE类似，以3′RACE cDNA为模板，反应体系同上，用AUAP和3GSP 1/3/5和3GSP 2/4/6分别代替UPM和5GSP 1/4/7和5GSP 2/5/8进行巢式PCR扩增。PCR扩增条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃继续延伸5 min；4 ℃保温。

对RACE产物分别进行回收、克隆和测序。

1.2.4 TUB基因cDNA编码区的克隆 在获得各个目的基因的全长cDNA序列后，利用Primer Premier 6.0分别设计了各自基因cDNA编码区的引物（表2），由生物公司合成并通过PAGE方式进行纯化。

同理，以赤桉嫩叶总 cDNA为模板，选用各自的引物进行PCR扩增，反应体系和条件同保守区片段的扩增，用TUB 1/2/3 F1& TUB 1/2/3 R1代替EC-TUB F1& EC-TUB R1进行扩增，反应结束后，对产物分别进行回收、克隆和测序。

1.2.5 EC-TUB基因的生物信息学分析 在获知EC-TUB基因保守片段、5′RACE产物和3′RACE产物序列后，将其序列进行拼接，经过比对分析后获得了EC-TUB基因的全长cDNA，通过网上资源和生物信息学软件对基因的ORF、功能以及其他特性进行分析和预测。

2 结果与分析

2.1 赤桉嫩叶总RNA的提取质量

取3 μL RNA样品进行电泳检测，电泳结束后在凝胶成像系统观察RNA条带的清晰度和完整性（图1）。由图1可以看出，赤桉嫩叶中所提取的总RNA效果较好，其电泳条带清晰整齐，无拖尾，而且28 S条带的亮度约为18 S的2倍，具有较高的纯度和完整性，可用于后续的cDNA反转录试验。

2.2 EC-TUB基因各目的片段的分离

以反转录的cDNA为模板，使用EC-TUB F1& EC-TUB R1引物组合进行PCR扩增，得到一条了约900 bp的片段。将此基因片段进行克隆和测序获得序列信息，经由Vector NTI 11.0和NCBI Blast上进行比对分析后，确认此序列片段是TUB基因的保守区部分片段。

以5′ RACE cDNA为模板，5′ RACE引物与UPM为引物进行两轮巢氏PCR扩增后，在1.2%的琼脂糖凝胶中，100 V电泳40 min，获得了条带清晰特异、大小分别为850 bp（图3A）、500 bp左右的DNA条带（图3B）。此外，利用3′ RACE cDNA和相应的引物进行PCR扩增后，通过电泳获得了830 bp（图3C）和460 bp左右的产物条带（图3D）。最后，根据设计的全长cDNA的ORF引物，也获得了各个目的基因的ORF片段（图3E）。

2.4 生物信息学分析

2.4.1 EC-TUB基因的全长cDNA序列分析 将5′ RACE和3′ RACE各片段测序结果去除载体序列部分，并与保守区部分片段进行拼接后，获得了3条EC-TUB基因的全长cDNA。此外，通过对3条基因的ORF片段进行克隆和测序后，也与相应的拼接序列信息相符合。通过生物软件Vector NTI 11.0将测序结果分析，得出3条EC-TUB基因的序列特征（表3），EC-TUB 1与EC-TUB 2和EC-TUB 3只有1个氨基酸序列的差异，而且在C-末端的多变区，说明这3个EC-TUB的家族基因之间的同源性很高，但是非编码区的长度和序列却有很大差异，可能会具有不同的功能。

2.4.2 EC-TUB基因的蛋白质序列与亲缘进化关系分析 应用Vector NTI 11.0将EC-TUB基因的ORF翻译成蛋白质序列，并与其它不同来源的TUB蛋白进行比对分析，发现赤桉的3个EC-TUB蛋白与其他物种TUB蛋白同源性较高，高达95%以上，由此可推测这些基因是TUB家族基因（图4）。TUB蛋白质序列是高度保守的，N-端的MRECI序列为微管蛋白转录后调控信号[16-18]，142～148 aa存在1个微管蛋白信号片段GGGTGSG，这个片段是GTP核苷酸结合位点，是α和β两种分子结合所必须的重要结构[19]，262～392 aa为TubulinC-terminal domain，同时在C-端有1个Tyr，它在序列的酪氨酸化和去酪氨酸化过程中有重要作用[20-21]。此外，C-末端呈强酸性，后40个aa序列有47%为酸性aa，可能是AMP或正离子（如Ca2+）的结合部位[4]。

2.4.3 分子系统进化聚类分析 为探讨EC-TUB基因与其他植物同类基因的亲缘进化关系，应用ClustalX 2.0和MEGA4.0软件对该基因编码的蛋白质与桦树、葡萄、鹰嘴豆、大豆、棉花等物种的TUB氨基酸序列进行亲缘进化关系分析（图5）。结果显示，整个进化树的遗传距离为0.000～0.180，种间遗传距离为0.000～0.178；蓖麻、垂枝桦的TUB和EC-TUB 1聚为1个分支，位于系统进化树的前端；巨桉的TUB和EC-TUB 3聚为1个分支，位于中间；而EC-TUB 2又与巨桉的TUB和EC-TUB 3聚为1个分支，位于靠后的位置。由此说明TUB是一种在进化上非常保守的蛋白，蓖麻、垂枝桦的TUB和EC-TUB 1处于较原始的地位，巨桉的TUB和EC-TUB 3处于中间的位置，而EC-TUB 2是整个进化树中最进化的1个TUB蛋白。

2.4.4 EC-TUB的理化特性分析 运用生物软件Antheprot 5.0和ExPASy-ProtParam tool对3个EC-TUB蛋白质序列进行理化性质的分析和预测（表4），发现3者之间的蛋白质理化性质基本相似，差异很小，都属于亲水性的稳定蛋白，在pH7.0的溶液中带有负电荷。

大量的原核和真核生物的tubulin蛋白同源性很高，序列结构比较相似。从图6可以看出，3个EC-TUB蛋白都有1个跨膜结构域，它们的位置分别在整个序列的第137～147 aa，138～146 aa，138～146 aa的位置，此结构便于TUB蛋白附着在膜上行使功能[17]。

根据软件Antheprot 5.0分析，在3个EC-TUB蛋白质序列中，都各自有3个明显的信号肽剪切位点（图7），都分别在146、278、389 aa位置上，其中以278 aa位置可能性最大，并且此位点后的肽段为膜外区，由此推测这些信号肽具有导向作用，可能参与蛋白质的运输过程，该蛋白经过信号肽引导后结合到膜上，而亚细胞定位预测结果（表5）显示，EC-TUB主要在细胞质中分布，这与其他物种该基因相关研究结论相符合。

经过Swissmodel Server和VMD1.8.5软件的分析，发现在EC-TUB经过多次折叠后，形成了三维立体结构（图8）[20]。由于3个EC-TUB的蛋白序列高度相似，所以他们的结构也是一样的。EC-TUB的三维立体结构以α-螺旋和β-片层结构区为主，有10个α-螺旋11个β-片层结构区。同时转录后调控信号（Met1Arg2Glu3Cys4Ile5）[21]，微管蛋白聚合信号（Gly142Gly143Gly144Thr145Gly146Ser147Gly148）以及酪氨酸活性位点（Tyr408）等几个调控位点和重要结构出现此立体结构中。

3 讨论与结论

本研究从赤桉中得到3个EC-TUB基因的cDNA序列。通过生物信息学分析发现赤桉的3个EC-TUB蛋白与其他物种TUB蛋白同源性高达95%以上，并且存在典型的微管蛋白转录后调控信号和微管蛋白信号片段，3个EC-TUB的理化特性、跨膜结构、亚细胞定位、信号肽剪切位点以及三维立体结构也都具有TUB蛋白的典型特征，因此推测它们可能在桉树纤维细胞的发育有很大的相关性，对于桉树的快速生长有一定的作用。同时，3个EC-TUB的亲缘关系远近不同，推测它们的功能存在一定的差异。

由于这些基因编码的蛋白质序列高度保守，因此，可以利用RACE结合RT-PCR的方法进行cDNA的克隆。研究表明，大花序桉、巨桉、赤桉尾叶桉、尾巨桉等树种的纤维形态差异明显[24-26]，是否与这些树种中的TUB基因功能差异有关需要进一步的研究来证实。EC-TUB基因的生物信息学分析为研究该基因在不同树种或无性系中的表达情况，分离纯化该蛋白以及研究其功能等提供了重要的参考依据。同时为进一步作为荧光定量PCR的内参基因分析提供了材料，也为研究其它微管蛋白基因奠定了基础。

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