易克贤 郑金龙 习金根等

摘 要 利用AFLP分子标记技术对181个中国柱花草胶孢炭疽菌菌株进行了基因组DNA分析。分析结果表明柱花草胶孢炭疽菌株DNA存在显著的多态性。聚类分析结果表明181个中国柱花草胶孢炭疽菌株可划分成4大组，但大多数聚于第Ⅰ和Ⅱ组，而第Ⅰ、Ⅱ组下又分别分为4个亚组，表明中国柱花草胶孢炭疽菌正在出现种内遗传分化。同时实验结果还表明中国菌株存在着广泛的生物多样性和遗传变异性，海南菌株与广东、广西的菌株相比多样性较丰富，致病力更强；而海南菌株又以东方、昌江、中国热带农业科学院儋州所部（简称“两院”）3个地区的菌株多样性最为丰富，毒性谱最广泛，这可能与海南种植柱花草历史相对较长、引种活动和生产活动更为频繁等有关。

关键词 柱花草；炭疽病；遗传多态性；AFLP；分子标记

中图分类号 S541+.9 文献标识码 A

柱花草（Stylosanthes spp.）又名笔花豆（penciflower），天然分布在中南美洲、热带北美洲、非洲及东南亚[1]。是全球热带地区栽培面积最大应用最广泛的优良豆科牧草，它具有产量高、耐旱、耐酸、耐贫瘠等优良特性，适于在热带、南亚热带地区种植，具有很大的发展潜力[2]。

影响柱花草生产的主要病害是柱花草炭疽病（Stylo anthracnose）。柱花草炭疽病主要由半知菌类炭疽菌属的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，有时亦可由该属的平头炭疽菌（C.truncatum）和菜豆炭疽菌（C. lindemuthianum）引起[3]。我国1962年从马来西亚引入柱花草[4]。自推广种植以来，由于受到柱花草炭疽病的危害，其产量受到严重影响[3]。柱花草炭疽病病原菌存在高度的生物多样性和遗传变异性[5]。各国的生产实践均证明一个抗病的柱花草品种使用10年后就会变成感病品种。而同一品种的柱花草在不同地点的感染程度有差异。炭疽菌分离菌的地理分布与柱花草宿主的自然分布相关。

AFLP技术因具有灵敏度高、快速、多态性强、DNA的用量少、重复性高等诸多优点，已被广泛用于真菌分类鉴定和遗传多样性的研究[6-7]。因此该技术可以检测到传统形态学方法无法区分的相似菌株种间和种内差别，它能快速侦测到新的侵染力强的菌株的出现及其种群的消长和迁移动态，便于及时采取相应的措施。

本文是在对我国柱花草炭疽病害调查和病原收集的基础上，进行病原菌基因组DNA的AFLP多态性分析，以进一步确定我国柱花草炭疽菌的遗传多态性和病原遗传分化类型，为我国柱花草炭疽病抗病育种、病害预测及防治等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1997年至2004年本研究团队对我国柱花草炭疽病进行了系统调查并分离获得病原菌703份，从中选取有代表性的181个菌株进行AFLP分析，菌株明细见表1。

1.2 方法

2 结果与分析

用8对引物对181个中国柱花草胶孢炭疽菌株进行分析，每对引物都产生了清晰的AFLP指纹，形成的AFLP图谱效果如图1、2、3、4。应用UPGMA法进行聚类，获得的聚类树状图如图5、6、7、8。结果表明，中国柱花草胶孢炭疽菌具有丰富的多样性。181个炭疽菌株之间的相似系数在0.24～0.57之间，同时在相似系数约0.24处聚成4大组。第Ⅰ组共73个菌株，又在相似系数约0.25处分化成4个亚组；第Ⅱ组共60个菌株，又在相似系数约0.30处分化成4个亚组；第Ⅲ、Ⅳ组分别仅有12、20个菌株。以上结果表明中国柱花草炭疽菌正在出现种内遗传分化。

结合聚类图5、6、7、8和表2可以看出，Ⅰ-1亚组、Ⅱ-1亚组、Ⅲ组菌株主要来自海南；Ⅰ-2亚组的菌株主要来自广东；Ⅱ-2亚组、Ⅱ-3亚组菌株主要来自广西；而Ⅰ-3、Ⅰ-4、Ⅱ-4、Ⅳ组菌株主要来自广东和海南，结果表明菌株间出现不同程度的地域分布规律。

从表3、4、5还可看出，第Ⅰ组菌株侵染圭亚那、有钩、粗糙、西布拉等所有的10个柱花草寄主品种，而第Ⅱ、Ⅳ组只侵染其中的5个寄主品种，第Ⅲ组仅侵染其中的4个寄主品种，说明第Ⅰ组菌株的毒力较强，毒性谱非常广泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ组菌株的毒性谱较窄。从各省区的菌株组型分布情况看，海南东方、昌江、两院的菌株多样性丰富，覆盖了所有的4个组型，而广西和广东菌株则相对简单。这可能与海南种植柱花草历史较长、大量从国外引种有关。

3 讨论与结论

3.1 柱花草胶孢炭疽菌株DNA存在显著的多态性

本文采用8对不同的引物对181个来自海南、广东和广西的柱花草胶孢炭疽菌株进行了较为全面和系统的AFLP分析，结果表明供试柱花草胶孢炭疽菌株DNA存在显著的多态性。

181个炭疽菌株之间的相似系数为0.24～0.57，同时在相似系数约0.24处聚成4大组，但大多数菌株聚于第Ⅰ和Ⅱ组。而第Ⅰ组又在相似系数约0.25处分化成4个亚组；第Ⅱ组又在相似系数约0.30处分化成4个亚组；表明中国柱花草胶孢炭疽菌正在出现种内遗传分化，这与易克贤等人的研究相一致[10]。

3.2 柱花草胶孢炭疽菌株遗传多态性具有地域性差异

本文的研究结果表明海南、广东和广西3省区柱花草胶孢炭疽菌株DNA遗传多态性丰富程度海南菌株大于两广的菌株，而且同一省区内不同地方的菌株其遗传多态性亦表现出地域性差异。其中海南菌株又以东方、昌江、儋州两院三地的菌株多样性最为丰富，毒性谱最广泛，这可能与各地柱花草的引种活动、推广种植的时间、规模程度和生态条件差异有关，引种和种植时间越长，病原菌为适应当地环境，遗传变异和进化必然更加活跃[11]。

3.3 柱花草胶孢炭疽菌株表现出一定程度的专化寄生性

本研究结果表明，第Ⅰ组菌株侵染圭亚那、有钩、粗糙、西布拉等所有的10个柱花草寄主品种，而第Ⅱ、第Ⅳ组只侵染其中的5个寄主品种，第Ⅲ组仅侵染其中的4个寄主品种，说明第Ⅰ组菌株的毒力较强，毒性谱非常广泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ组菌株的毒性谱较窄。

3.4 AFLP可用于柱花草胶孢炭疽菌株种群遗传变异的监测和抗病育种

国外许多报道[12-14]均表明在柱花草的起源中心-南美和长期种植区其炭疽病菌存在着广泛的生物多样性和遗传变异性，而在新种植区则相对简单。本文研究表明，与国外研究结果相比，中国柱花草炭疽病菌遗传多样性要简单得多，因此今后从其它国家进行柱花草引种和推广过程中，应特别注意病原菌的检疫和病害监测，以防止新的侵染力强的病原菌株或小种从国外或老种植区带入新区，影响中国柱花草的生产。此外本文研究结果表明中国柱花草炭疽病菌正出现一些新的种内遗传分化，因此有必要不断加强综合抗病品种的选育。

参考文献

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