董荣书 张洁 黄艳霞等

摘 要 采用水培的方法，设3个磷水平，7个菌株，通过对株高、茎叶鲜重、茎叶干重、固氮酶活性、茎叶氮含量、茎叶磷含量的测定及综合分析，确定使热研2号柱花草接种不同根瘤菌菌株达到最佳促生性能的磷浓度。结果表明：7个菌株在中磷时鲜重和含氮量最大，低磷不利于鲜重和含氮量的增加；经主因子综合分析，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在高磷时对热研2号柱花草有最好的固氮促生效果，菌株LZ3-2、BS1-1、PN13-3在中等磷条件下有最好的固氮促生效果，菌株FS3-1-1在高磷和中磷都有最好的固氮促生效果。

关键词 热研2号柱花草；根瘤菌；最佳促生效果

中图分类号 S54 文献标识码 A

热研2号柱花草[Stylosanthes guianensis（Aublet）Swartz cv. Reyan No.2]由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草研究中心选育自184柱花草（Stylosanthes guianensis CIAT184），在我国热带、亚热带地区有较强的适应性[1]。热研2号柱花草具有茎叶产量高，适口性好，营养丰富，刈割后再生能力强，接种根瘤菌后固氮能力强的特性，在我国南方广泛用于饲草、绿肥及水保[2-7]。接种高效根瘤菌是柱花草栽培的重要手段[8]，能有效的提高柱花草的产量及含氮量。目前在我国筛选出适合于热研2号柱花草的高效菌株有6个[9]，相对于不接种可增产达4.98倍、含氮量增加可达2.04倍[10]。豆科植物接种根瘤不仅与植株与菌株基因型的搭配有关，还受外界环境的影响[11-12]。磷在豆科作物的生长和结瘤固氮过程中发挥着重要作用[13-14]。缺磷对豆科作物根瘤形成和生长的影响大于其对植物体生长的影响[15-16]，对大豆、蚕豆等作物的研究结果表明，在一定范围内磷可以促进结瘤和固氮，但过多也会抑制根瘤的固氮效果[17-18]。在柱花草方面尚无对柱花草-根瘤菌体系最适磷浓度的研究，本研究通过水培对接种不同根瘤菌的热研2号柱花草进行不同浓度的磷处理，确定使热研2号柱花草接种不同根瘤菌菌株达到最佳促生性能的磷浓度，以期为柱花草高产栽培的科学用肥及根瘤菌的科学施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

热研2号柱花草由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草中心提供；供试菌株[19]及来源见表1；磷源用KH2PO4（AR），不同磷处理间少的K用K2SO4（AR）补足。

1.2 方法

1.2.1 无菌种苗的准备 柱花草种子剥去种皮，在80 ℃的热水中浸泡5 min；分别于95%的乙醇（V/V，下同）和2 g/L的HgCl2溶液中浸泡5 min和3 min（灭菌）；取出，用无菌水冲洗5～6次；种子撒播在已灭菌铺有发芽纸的培养皿中，发芽纸上浇无菌的50 μmol/L硫酸钙溶液；于黑暗中发芽。待芽长至1 cm左右时移到1.5 mL的切除底部的小离心管中培养，离心管事先分装好MS培养基，离心管固定在0.2 cm厚的定植板上，最后将定植板放在装有1/2 Hoaglang营养液[8]的面包箱中育苗2周。

1.2.2 根瘤菌菌液的准备 以YMA（Yeast Mannitol Agar）培养基作为基础培养基，配制固体、液体培养基放置2 d确认无污染后将保存的各菌株活化于固体培养基上；培养5 d后将菌落接种于液体培养基中，在180 r/h、28 ℃摇床上培养至对数生长期（OD600>0.9）。

1.2.3 水培系统的准备、移苗及处理 水培试验用2 L小桶，小桶先用1 g/L高锰酸钾浸泡2 min然后用去离子水冲洗晾干，小桶外围用黑色袋套住遮光。定植板用厚1 cm泡沫板，每块泡沫板上四边均匀钻4个小洞。水培通气装置有通气泵、通气管、通气石、通气接口、定时器。

育苗2周后，将离心管带苗移到小桶定植板上，用海绵固定。移苗后第一周用1/4 Hoaglang营养液稳定苗生长；移苗第二周用氮浓度100 mol/L的低氮营养液，同时接菌。将备用的菌液淋在根上，每株柱花草接5 mL菌液，并暂停通气；3 d后再通气。2周后每4 h通气15 min。每周更换一次营养液；每2 d调一次营养液pH值至5.8。

1.2.4 试验设计 采用双因子随机区组试验。菌株因子设8个水平（即设8个处理，包括接种R1～R7根瘤菌和不接种对照R8）；磷浓度因子设PL（低磷）、PM（中磷）、PH（高磷）3个水平，磷浓度CP：分别为5、150、200 μmol/L；4次重复。营养液pH值为5.8。

1.2.5 取样及各指标的测定 3个月后进行收获。剪下茎叶称鲜重后放入信封于烘箱105 ℃杀青20 min，75 ℃烘干后称重。地上部干样用于氮的测定。将样品粉碎，先用H2SO4-H2O2进行消煮，用自动定氮仪（Kjedahl 2300）测定全氮。

用乙烯还原法通过气相色谱测定根瘤固氮酶活性[8]。固氮酶活性以每小时每克鲜瘤将乙炔转化为乙烯的能力表示[μmol/（h·g）]。

1.2.6 数据处理与分析 试验中所有的数据均用Microsoft Excel 2000、JMP9等统计软件进行统计和方差分析，以Tukey HSD作为差异显著性标准，显著水平p<0.01。

2 结果与分析

2.1 热研2号柱花草接种不同根瘤菌鲜重和含氮量最佳磷浓度的确定

热研2号柱花草接种不同根瘤菌茎叶鲜重在不同磷处理间差异显著，不同菌株间变化情况也有差异。热研2号柱花草接种7株菌株后茎叶鲜重在不同磷处理下的变化情况可分为3类：接种菌株R1、R2、R3后中磷的茎叶鲜重显著高于高磷和低磷，高磷和低磷间差异不显著；接种菌株R4后，中磷>高磷>低磷，三者差异显著；接种菌株R5、R6、R7后，高磷和中磷间差异不显著，低磷显著低于二者。

热研2号柱花草接种7个根瘤菌菌株在不同磷处理下茎叶含氮量除接种菌株R1差异不显著外，其他6个菌株都呈现中磷显著高于低磷且高磷与低磷差异不显著的规律。

2.2 热研2号柱花草接种根瘤菌的最适磷浓度的确定

通过对不同磷处理下热研2号柱花草接种不同根瘤菌的株高、茎叶干重、固氮酶活性、茎叶氮含量、茎叶磷含量等指标进行因子分析，前2个因子的累积贡献率达到79.58%（一般情况下，累积贡献率超过75%即可），因此可提炼2个公因子。通过最大方差旋转法得到旋转因子载荷矩阵。在第一公因子（F1）中，株高、固氮酶活性、茎叶干重、茎叶含氮量等5个指标上具有大的载荷（一般情况下，将载荷绝对值大于0.4的视为高载荷），F1是除植株含磷量外的性状的综合体现，代表了热研2号柱花草接种根瘤菌后在不同磷水平下的生物量和固氮能力，F1的方差贡献率为58.63%；在F2中，植株含磷量具有较高的正载荷，F2可称为植株含磷因子，该因子的方差贡献率为20.95%。

根据各个观测值在第一和第二主因子上的标准得分，绘制关于生物量和固氮能力（X轴）和植株含磷量（Y轴）的二维平面图。R1H、R2M、R3H、R3M、R4H、R5M、R6M、R7H位于图中的第1象限在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是正值，热研2号柱花草菌株接种菌株R1、R7的最适磷浓度为高磷，接种菌株R2、R4、R5、R6的最适磷浓度为中磷，接种菌株R3在中磷和高磷都能达到较好的固氮促生效果；R1L、R2L、R3L、R4L、R5L、R6L、R7L位于图中的第3象限，在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是负值，低磷条件不利于各菌株与热研2号柱花草的共生固氮作用。

3 讨论与结论

土壤缺磷是限制豆科作物生产的重要因素[20-21]，适量的磷不仅能促进植物的生长，还能促进豆科作物结瘤固氮作用，在豆科植物上有“以磷促氮”的说法[22]。程凤娴[23]在试验中证明了磷对根瘤菌共生固氮起着重要的作用，磷能促进根瘤菌的固氮活性。在大豆的研究中当磷浓度为9.3～37.0 mg/L时，大豆的植株生长量、根瘤数、根瘤干重、固氮活性和氮积累量会大幅下降[17]。本研究不同磷处理对热研2号柱花草接种不同根瘤菌后鲜重和含氮量的影响呈现低磷不利于热研2号柱花草鲜重和含氮量的增加，中磷条件对柱花草鲜重和含氮量的促进作用最大，随磷浓度的增加柱花草的鲜重和含氮量反而降低的规律，但不同菌株的接种效果存在较大的差异。接种菌株YM11-1、LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2在磷浓度为150 μmol/L时有最大的鲜重，接种菌株BS1-1、CJ1、PN13-3在150～200 μmol/L都有最大的鲜重，接种菌株LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2、BS1-1、CJ1、PN13-3在150 μmol/L的含氮量最大。齐敏兴等[24]在不同磷水平对接种根瘤菌紫花苜蓿生长特性影响的研究中也得到类似的结果，但热研2号柱花草最佳磷水平的磷浓度较紫花苜蓿的（1 000 μmol/L）低。

不同根瘤菌对磷素的需求量及吸收利用力存在很大的差异，豆科植物接种根瘤形成共生系统，磷对共生系统的影响主要由磷对根瘤和对植株的影响构成，研究结果表明：植物结瘤和保持固氮酶活性比正常生长需更多的磷[25-26]，但过高的磷会加大植株的呼吸强度，引起养分消耗，不利于植株的正常发育[27]。所以，根瘤菌高效固氮的条件筛选必须根据栽培目的选择筛选的指标，通过综合分析确定使植株和根瘤都达到最佳生长状态的磷浓度。本研究在通过鲜重和含氮量确定热研2号柱花草接种不同根瘤菌的最佳磷浓度的基础上，加入茎叶干重、固氮酶活性、茎叶氮含量、茎叶磷含量等指标进行主因子分析，得出不同菌株与热研2号柱花草共生的最适磷浓度，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在磷浓度为200 μmol/L时对热研2号柱花草有最好的固氮促生效果；菌株LZ3-2、BS1-1、CJ1在磷浓度为150 μmol/L条件下有最好的固氮促生效果；菌株FS3-1-1在磷浓度为150～200 μmol/L都有最好的固氮促生效果。

参考文献

[1] 蒋侯明， 何朝族， 李居正， 等. 热带优良豆科牧草——热研2号柱花草的选育及推广[J]. 热带作物研究， 1992（1）： 62-66.

[2] 蒋侯明， 何华玄. 热研2号柱花草栽培及利用[J]. 草业科学， 1993（1）： 51-52.

[3] 郑邦兴， 沈裕芳. 柱花草在我省大农业中的应用[J]. 广东畜牧兽医科技， 1995， 20（3）： 31-32.

[4] 唐燕琼， 吴紫云， 刘国道， 等. 柱花草种质资源研究进展[J]. 植物学报， 2009， 44（6）： 752-762.

[5] 庄道源， 黎学培， 黎金瓦. 胶园套种山毛豆和柱花草技术推广[J]. 热带农业科学， 2011， 31（10）： 1-3.

[6] 白昌军， 刘国道， 何华玄， 等. 海南半干旱地区芒果间作柱花草及作物效益初探[J]. 草地学报， 2003， 11（4）： 350-357.

[7] 蔡小艳， 赖志强， 易显凤， 等. 我国南方柱花草的利用现状及发展对策[J]. 上海畜牧兽医通讯， 2010（3）： 51-53.

[8] 林志强. 柱花草栽培技术[J]. 广东农业科学， 2008（7）： 135-137.

[9] 董荣书. 热研2号柱花草高效固氮根瘤菌的筛选[J]. 热带作物学报， 2013， 34（7）： 1-7.

[10] 董荣书. 柱花草高效固氮根瘤菌株系的筛选[D]. 海口： 海南大学， 2010： 25-28.

[11] Pirbalouti A G， Allahdadi I， Akbari G A， et al. Effects of different strains of Rhizobium legominosarum biovar phaseoli on yield and N2 fixation rate of common bean（Phaseolus vulgaris L.）Iranian cultivars[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2006， 9（9）： 1 738-1 743.

[12] Aguilar O M， Riva O， Peltzer E. Analysis of Rhizobium etli and of its symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（37）： 13 548-13 553.

[13] Marschner H. Mineral Nutrition of Higher Plants. 2nd Edition[M]. London， Harcourt Brace & Company， 1995： 899.

[14] Robson A D， Ohara G W， Abbott L K. Involvement of phosphorus in nitrogen fixation by subterranean clover（Trifolium subterraneum L.）[J]. Australian Journal of Plant Physiology， 1981， 8（5）： 427-436.

[15] Ohwaki Y， Sugahara K. Active extrusion of protons and exudation of carboxylic acids in response to iron deficiency by roots of chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Plant and Soil， 1997， 189（1）： 49-55.

[16] Israel D W. Investigation of the role of phosphorus in symbiotic dinitrogen fixation[J]. Plant Physiology， 1987， 84（3）： 835-840.

[17] 丁 洪， 李生秀. 磷素营养与大豆生长和共生固氮的关系[J]. 西北农业大学学报， 1998（5）： 70-73.

[18] 王清湖， 敬 岩， 张 慧， 等. 接种根瘤菌和施磷肥对蚕豆共生固氮及产量的影响[J]. 甘肃科学学报， 1996（4）： 16-19.

[19] 董荣书， 黄艳霞， 刘国道， 等. 柱花草根际土著根瘤菌的丰度及其遗传多样性[J]. 热带作物学报， 2010， 31（6）： 908-913.

[20] Yan X L， Beebe S E， Lynch J P. Phosphorus efficiency in common bean genotypes in contrasting soil types. Ⅱ. Yields response[J]. Crop Science， 1995， 35： 1 094-1 099.

[21] 廖 红， 严小龙. 华南酸性红壤中菜豆种质耐低磷特性的评价[J]. 华南农业大学学报， 1998， 19（2）： 20-25.

[22] 晁明亮. 以磷增氮[J]. 安徽农业科学， 1963（1）： 62-63.

[23] 程凤娴， 曹桂芹， 王秀荣， 等. 华南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的发现及应用[J]. 科学通报， 2008（23）： 2 903-2 910.

[24] 齐敏兴， 刘晓静， 张晓磊， 等. 不同磷水平对接种根瘤菌紫花苜蓿生长特性的影响[J]. 草原与草坪， 2013（1）： 50-53.

[25] 刘丽君， 孙聪姝. 氮肥对大豆结瘤及叶片氮素积累的影响[J]. 东北农业大学学报， 2005， 36（2）： 133-137.

[26] Li X L， Cao Y P. Study on m ethod for investigating nutrient changes in the hypae-so il inte rface[J]. Beijing Ag ric Univ， 1992， 18（1）： 59-63.

[27] 东北师范大学生物系. 大豆生理[M]. 北京： 科学出版社， 1981： 204-206.

责任编辑：沈德发