申树林梁季鸿**朱春晖张 迅刘 宁

陆庆华1刘德铭2唐石伏2杨文涛3李群生3

1. 广西医科大学第一附属医院男性科（南宁 530021）;

2. 广西柳州市中医院; 3. 广西中医药大学附属瑞康医院

免疫共沉淀联合质谱法筛选和鉴定TS-CBP86-IV相互作用蛋白*

申树林1梁季鸿1**朱春晖1张 迅1刘 宁1

陆庆华1刘德铭2唐石伏2杨文涛3李群生3

1. 广西医科大学第一附属医院男性科（南宁 530021）;

2. 广西柳州市中医院; 3. 广西中医药大学附属瑞康医院

目的利用免疫共沉淀联合质谱分析方法，分别从人精子总蛋白和重组BL21细胞总蛋白中筛选和鉴定与TS-CBP86-IV相互作用的蛋白质。方法用克隆技术得到TS-CBP86-IV cDNA编码基因，构建原核表达载体，导入大肠杆菌BL21中诱导表达纯化重组蛋白；另外收集人精子细胞，提取总蛋白，用特异抗体通过免疫共沉淀法分离出TS-CBP86-IV蛋白复合体，再用质谱鉴定可能与其相互作用的蛋白质。结果利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选到16个与TS-CBP86相互作用的候选蛋白质，数据库检索发现部分蛋白具有相同功能注释，参与精子运动调控。结论 免疫共沉淀联合质谱分析方法成功筛选和鉴定出TS-CBP86-IV相互作用蛋白质, 为进一步研究TS-CBP86-IV的功能奠定了良好的基础。

睾丸特异性钙结合蛋白; 免疫沉淀法; 质谱分析法; 蛋白质相互作用

睾丸特异性钙结合蛋白CBP86-IV（Testis-specif c calcium-binding protein，TS-CBP86-IV）是我们研究弱精子症精子差异表达蛋白组所鉴定出的蛋白质之一。前期的研究采用基因克隆、原核表达和免疫学方法成功制备了TS-CBP86-IV多克隆抗体，并运用该抗体对人精子细胞TS-CBP86-IV表达量进行了检测[1]，取得了阶段性成果。

本文采用免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation, Co-IP），以TS-CBP86-IV蛋白特异性抗体为诱饵，分别在人精子蛋白和重组原核表达TS-CBP86-IV蛋白的大肠杆菌总蛋白中进行免疫共沉淀实验，钓取TSCBP86-IV蛋白复合体，然后使用高分辨率质谱技术鉴定出可能与之相互作用的蛋白，现报告如下。

材料与方法

一、主要试剂

Percoll 购自索莱宝生物有限公司, TS-CBP86-IV抗体由Invitrogen公司制备和纯化；非变性蛋白裂解液购自碧云天生物科技有限公司；免疫共沉淀试剂盒购自Life公司；其他试剂均为国产分析纯。人精子标本来自我院男性科门诊患者。

二、精液标本的收集和制备

精液标本检验依据WHO（第五版）人类精液和精子宫颈粘液相互作用检查实验室手册规定的标准[2]。收集正常精液标本30份，待精液液化后用60% Percoll单层（800×g，20 min）离心, 去除精浆及圆形细胞, 然后用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤两次后计数，弃掉上清后，细胞沉淀冻存于-80℃冰箱备用。

三、精子非变性总蛋白提取

使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液（使用前加入终浓度1 mM PMSF）提取精子总蛋白。从-80℃冰箱中取出细胞样品, 按照1:10（m/v）的比例加入细胞裂解液, 上下颠倒混匀，室温放置10min,充分裂解；10 000×g离心5 min，取上清，即为非变性精子总蛋白。

四、大肠杆菌非变性总蛋白提取

按照之前报道的实验方法和条件[1]，在大肠杆菌BL21菌株中中诱导表达TS-CBP86-IV重组蛋白，并使用Western及IP细胞裂解液提取非变性总蛋白样品。

五、TS-CBP86-IV蛋白复合体免疫共沉淀

使用Novex Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein A（Life Technologies）试剂盒进行免疫共沉淀实验。取50μL磁珠于1.5 mL EP管中，磁力架吸附，弃上清待用。取10μg CBP86-IV抗体加入200μL漂洗缓冲液，轻轻混匀后加入处理好的磁珠中，振荡混匀处理10 min，磁力架吸附去上清；再加入200μL Ab Binding＆Washing Buffer重悬磁珠并进行清洗。200μL抗体结合缓冲液（500 mmol Na3PO4，5 mol NaCl）重悬磁珠，并加入250μl 5 mM BS3（Bis suberate）溶液，室温放置30 min，不断混匀；加入12.5μL终止缓冲液（1M Tris，pH7.5），室温放置15 min，磁力架吸附去上清，漂洗缓冲液清洗3次。

将非变性精子总蛋白和大肠杆菌总蛋白分别加入处理好的磁珠中，室温轻柔混匀10min，磁力架吸附，弃上清，200μL漂洗缓冲液清洗3次，加入20μL洗脱缓冲液混匀，常温放置2 min，磁力架吸附，取上清置于清洁的EP管中，即为免疫共沉淀产物，-20℃保存或继续质谱鉴定实验。

六、TS-CBP86-IV蛋白复合体质谱鉴定

免疫共沉淀产物超滤离心置换buffer后，使用胰蛋白酶进行酶解消化，37℃酶解过夜后，ZipTip微量层析柱（Millipore）脱盐处理，Easy-nLC 1000 nanof ow（Thermo Scientif c）毛细管液相分离后，使用LTQ-Orbitrap Elite（Thermo Scientif c）组合式质谱仪进行质谱鉴定，液质联用程序为系统预设标准程序，根据仪器实际运行情况进行微调。质谱结果使用Proteome Discoverer 1.3（Thermo Fisher Scientif c）软件与Uniprot数据库进行比对，获得与CBP86-IV可能存在相互作用关系的蛋白质信息。

结 果

一、大肠杆菌非变性总蛋白免疫共沉淀鉴定结果

将从大肠杆菌总蛋白中获得的蛋白复合体进行酶解和质谱鉴定，共有13个蛋白质得到有效鉴定，其中包括TS-CBP86-IV重组表达蛋白（蛋白编号O75952），具体的鉴定结果，见表1。

二、人精子非变性总蛋白免疫共沉淀鉴定结果

将从人精子总蛋白中获得的蛋白复合体进行酶解和质谱鉴定，共有3个蛋白质得到有效鉴定，具体的鉴定结果，见表2。

讨 论

相关研究报道[3]和我们的前期实验[1]均发现：TSCBP86-IV可能与精子的运动有关，但具体的作用机制仍然不清楚。近年来，从蛋白质之间的相互作用网络（即蛋白质复合体）中研究某种蛋白质功能成为新热点，与之相应的技术方法也日趋成熟，如免疫共沉淀、串联亲和纯化技术、高分辨率质谱术等为相互蛋白质复合体的纯化和鉴定提供了有力工具[4-6]。

表1 大肠杆菌非变性重组TS-CBP86-IV蛋白复合体所鉴定的蛋白

表2 人精子总蛋白中TS-CBP86-IV复合体所鉴定的蛋白质

根据已有的文献报道[7]，免疫共沉淀方法主要用于潜在相互作用蛋白的验证实验，即首先确定可能与目的蛋白存在相互作用的蛋白质，通过原核表达、蛋白纯化等方法，获得高纯度和质量的该蛋白天然表达形式，然后通过免疫共沉淀技术结合非变性蛋白质电泳或SDS-PAGE确定目的蛋白与该蛋白之间的相互作用关系。本实验则是使用免疫共沉淀技术从总蛋白中直接钓取可能的相互作用蛋白，该研究方法在以前应用的并不多，究其原因，主要是由于总蛋白样品中蛋白数量巨大，可能会有假阳性或非特异性吸附的蛋白质存在；同时总蛋白提取中，样品杂质极有可能干扰免疫共沉淀的过程，导致实验失败；而候选的相互作用蛋白也有可能由于表达量过低或存在修饰加工形式，增加后续质谱鉴定的难度。在本实验中，我们使用了可靠的提取方法，获得质量较高的非变性精子总蛋白样品，同时高效价和特异性的多克隆抗体也最大程度上降低了假阳性鉴定结果的出现，进一步提高了实验的成功率。

本实验应用免疫共沉淀联合质谱分析方法分别从人精子细胞和重组原核表达细胞中鉴定3种和13种蛋白。其中在两种细胞总蛋白中均鉴定到了血清蛋白的存在，这也是由于多克隆抗体的制备是在动物体内完成的，从血清中纯化抗体。虽然免疫共沉淀过程中使用BS3对抗体进行固定，也不可避免有一部分抗体被洗脱和鉴定出来，属于正常的实验结果。而在原核表达总蛋白中进一步鉴定到了重组TS-CBP86-IV蛋白，说明我们制备的抗体能够特异性吸附目的重组蛋白，这也是免疫共沉淀能够成功进行的关键，只有特异的吸附到目的重组蛋白才有可能鉴定到与之相互作用的蛋白质。由于重组蛋白在大肠杆菌中表达量丰富，更容易在后续的质谱鉴定中获得可靠鉴定，同时使用异源总蛋白进行实验，可能会获得一些与TSCBP86-IV相互作用的异源蛋白质信息，这些蛋白也有可能在后续的研究中提供TS-CBP86-IV与其他蛋白相互作用的识别位点和构型信息，而进一步解释蛋白相互作用的具体机制。而在人精子细胞中，CBP86-IV表达量有限，获得的信息相对有限，但由于是在目的蛋白执行功能的细胞总蛋白中进行筛选，更有可能得到重要的相互作用蛋白信息。

本实验所鉴定的可能与TS-CBP86-IV有相互作用的候选蛋白，目前还未见有相关文献报道，还需要进一步通过体内外实验验证。而本实验采取的方法和策略、以及获得的实验数据，为进一步研究TS-CBP86-IV的功能奠定了良好的基础，同时也为研究精子蛋白复合体和相互作用关系提供了新的思路。

1 申树林, 梁季鸿, 朱春晖, 等. 睾丸特异性钙结合蛋白CBP86-IV表达水平变化及抗体制备. 中国男科学杂志2013; 27(10): 61-62, 66

2 陈振文, 谷龙杰. 精液分析标准化和精液质量评估-WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)出版. 中国计划生育学杂志2012; 20(l): 58-62

3 Naaby-Hansen S, Mandal A, Wolkowicz MJ,et al. (2002) CABYR, a novel calcium-binding tyrosine phosphorylationregulated f brous sheath protein involved in capacitation.Dev Biol2002; 242(2): 236-254

4 江月, 丛浩龙, 王健, 等. 串联亲和纯化技术筛选肠病毒71 型3D 聚合酶的相互作用蛋白. 第三军医大学学报2012; 34(6): 526-529

5 王成, 赵晓蒙, 帅勇, 等. 免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4 相互作用蛋白. 湖南师范大学自然科学学报2012; 35(2): 71-75

6 孙婷婷, 宋丽娜, 于淼, 等. 免疫共沉淀联合质谱对肝细胞核因子3β蛋白复合体的分离鉴定. 生物技术通讯2011; 22(5): 662-666

7 涂占晗, 林旭. 蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较. 中国当代医 2012; 19(14): 18-20

8 范翠英, 冯利兴, 樊金玲, 等. 重组蛋白表达系统的研究进展. 生物技术 2012; 22(2): 76-80

（2014-08-14收稿）

Screening and identification of TS-CBP86-IV interacting proteins using co-immunoprecipitation combining with mass spectrometry*

Shen Shulin1, Liang Jihong1**, Zhu Chunhui1, Zhang Xun1, Liu Ning1, Lu Qinghua1, Liu Deming2,Tang Shifu2, Yang Wentao3, Li Qunsheng3
1. Department of Andrology, the First Aff lated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China; 2. Liuzhou Hospital of Trational Chinese Medicine; 3. The Ruikang Hospital of Guangxi University of Trational
Chinese Medicine

Liang Jihong, Email: jihongliang@126.com

ObjectiveTo screen and identify interactional proteins with TS-CBP86-IV from total protein of human sperm and Escherichia coli BL21 using co-immunoprecipitation and mass spectrometry.MethodsCoding gene of TSCBP86-IV was cloned and inserted into prokaryotic expression vector, then the recombinant vector was transducted into Escherichia coli for its expression and purif cation; Human sperm cells were collected and their total protein was extracted. TS-CBP86-IV protein complex was separated by co-immunoprecipitation and the isolated protein was identif ed by mass spectrometry.ResultsA total of 16 proteins were identif ed by co-immunaprecipitaion combining with mass spectrometry. Several proteins identif ed were associated withregulation of sperm motility.ConclusionInteractional proteins with TSCBP86-IV were successfully identif ed by co-immuniprecipitation and mass spectrometry,which establish a solid base for future study of TS-CBP86-IV function.

Testis-specific calcium-binding protein; immuniprecipitation; mass spectrometry; protein interaction

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.002

R 446.121.3

资助: 国家自然科学基金资助项目(项目编号: 81260123); 广西自然科学基金资助项目(项目编号: 2012GXNSFAA053168)
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, Email: jihongliang@126.com