任超超，滕巧泱，申伟霞，李雪松，李国新，杨健美，闫丽萍，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

利用反向遗传技术构建细胞高适应性的H9N2流感病毒

任超超，滕巧泱，申伟霞，李雪松，李国新，杨健美，闫丽萍，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H9N2亚型禽流感病毒通常在鸡胚上增值性能高，但在细胞上增值能力差。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株，通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2，SH441）的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34（H1N1，PR8）的6个内部基因进行人工重组，拯救并获得了1株禽流感重组病毒441-PR8，并对它的生物学特性进行了研究。结果表明，重组病毒441-PR8株在细胞上的增殖能力明显高于野生毒株SH441，该重组病毒有望成为H9N2亚型禽流感疫苗研制的候选毒株。

禽流感病毒；H9N2亚型；H1N1亚型；反向遗传操作；重组病毒

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒属禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病。根据禽流感病毒致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，中国的低致病性禽流感疫情主要以H9亚型为主。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到[1]，我国自1994年由陈伯伦等[2]首次从鸡群中分离到H9亚型 AIV以来，该亚型禽流感病毒广泛存在于辽宁省、安徽省、山东省、广东省、福建省、江苏省、河南省、湖南省、湖北省、上海市、广西壮族自治区、云南省、四川省、新疆维吾尔自治区等全国大部分地区[3]。H9N2 亚型禽流感病毒虽然不引起感染的禽类大量死亡，但是由于该病毒传播能力极强，存在范围极广，导致产蛋下降、免疫抑制病、与其他病原共感染时常导致高死亡率。1998年，中国和韩国分别从猪的体内分离出H9N2亚型病毒[4,5]，提示病毒正在威胁包括人类在内的哺乳动物。由于抗原变异十分活跃，H9N2亚型禽流感给我国养禽业和人类健康带来了严重危害。

接种疫苗是预防禽流感发生与传播最有效的手段，对提高我国的禽病防治水平、保障我国养禽业的健康发展具有十分重要的意义。H9N2 亚型禽流感疫苗在我国普遍使用，在强大免疫压力下，H9N2亚型禽流感病毒变异加快，而作为禽流感疫苗应同时具有较强的免疫原性和良好生长特性，现有商品化灭活苗已无法完全保护鸡群免受 H9N2 亚型禽流感病毒流行株的感染。目前，通过对2008～2009 两年中不同地区分离到的 20 多株 H9N2 亚型禽流感病毒的序列分析和抗原交叉保护试验，筛选到1株具有良好抗原性的病毒株 A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2），简称SH441。据此，本研究旨在以PR8内部基因为骨架[6]，通过“6+2”反向遗传操作技术进行人工重组，拯救并获得1株具有良好免疫原性的重组病毒。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和病毒病毒PR8反向遗传操作系统（包括pBD-PB1、pBD-PB2、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS E67S[6]）、pBD载体、293T细胞和MDCK细胞由本实验室提供；SPF鸡胚购自北京梅里亚公司；H9N2亚型禽流感病毒SH441、A/Chicken/Shanghai/169/2009（169）、A/Chicken/Shanghai/340/2009（340）、A/Chicken/Shanghai/510/2009（510）、A/Chicken/Guangdong/1214/2009（1214）、A/Chicken/Hunan/2351/2009（235）、A/Chicken/Shangdong /2553/2009（2553）和A/Chicken/Shangdong/2567/2009（2567）保存于本实验室。

1.2 主要试剂TRIZOL、Pfx DNA Polymerase、LipofectamineTM2000、OPTI-MEM购自Invitrogen 公司；DNA Marker（DL2000）购自宝生物公司；限制性内切酶BspQI、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；DNA 纯化回收试剂盒和小剂量质粒抽提试剂盒分别购自Axygen 公司；去内毒素小量抽提质粒试剂盒购自于OMEGA公司。

1.3 引物根据流感病毒保守序列设计反转录12 bp引物和HA、NA片段通用扩增引物，见表1。

表1 12 bp引物及扩增流感HA和NA引物Table 1 12 bp primer and primers of HA and NA

1.4 重组质粒pBD-441-HA和pBD-441-NA的构建与鉴定按QIAGEN说明书，提取流感病毒SH441株的总RNA。用12 bp引物将病毒RNA进行反转录获得cDNA第一链。以此cDNA为模板，分别用sapI-HA-up、sapI-HA-down 和sapI-NA-up、sapI-NA-down为上下游引物（见表1），Pfx DNA Polymerase进行PCR, 扩增 SH441 HA 和NA全片段，并用1%琼脂糖电泳鉴定。PCR产物经割胶纯化后，用BspQ I酶切，并连接于同样酶切的pBD载体中。构建的重组质粒经PCR鉴定并测序。

1.5 转染按照OMEGA去内毒素小量抽提质粒试剂盒的说明书进行超纯度抽提质粒后，利用LipofectamineTM2000将所构建含SH441的HA和NA基因的质粒pBD-441-HA、pBD-441-NA与含有PR8病毒6个内部基因的质粒pBD-PB1、pBD-PB2、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS E67S共转染293T细胞。转染后6 h，弃去细胞上清，加入1 mL新鲜的OPTI-MEM培养液，于37℃的CO2培养箱中培养48 h。

1.6 获救病毒的鉴定和病毒滴度的测定转染48 h 后的细胞上清，接种9～11 日龄SPF 鸡胚，置于37℃孵化器内培养72 h，然后4℃过夜，收获鸡胚尿囊液。通过血凝试验测定尿囊液凝集红细胞能力，收集有血凝活性的尿囊液，分装并冻存于-80℃，命名为441-PR8株重组病毒。同1.3方法，PCR扩增重组病毒441-PR8株中的HA和NA片段，并用1%琼脂糖电泳鉴定，之后测定PCR扩增产物序列，比较与SH441序列是否一致。将尿囊液按10倍倍比稀释，把不同稀释度的重组病毒和SH441毒分别感染96孔板中密度长到80%的MDCK细胞，每孔加入100 μL病毒，每个稀释度做3 个重复，吸附了病毒的细胞在CO2培养箱继续培养72 h，观察细胞病变，然后利用Reed-Muench法计算TCID50。

1.7 病毒在细胞上生长曲线的绘制将441-PR8和SH441稀释为1000 TCID50/孔，按照这个稀释度感染六孔板中长至80%的MDCK细胞，每孔接毒量为100 μL。吸附1 h后，换入含有0.5 μg/mL的TPCKTrypsin的无血清培养液，在接毒6、12、24、36、48、60、72 h后，分别收集其细胞上清200 μL并补液200 μL，测定它们的血凝效价，每份样品重复3次，比较重组病毒441-PR8和SH441在MDCK细胞上的生长情况。

按上述方法同时进行重组毒441-PR8与本实验室保存的其他7株H9N2亚型禽流感病毒分离株在MDCK细胞系上生长特性比较，设PR8和PBS分别为阳性和阴性对照。在接毒后24、48、72 h取上清测定血凝效价，分析各病毒株在细胞上的生长情况。

1.8 在MDCK细胞上病毒接毒量的比较为了将来在细胞上大批量扩增病毒，本研究对在T25细胞培养瓶中扩增的条件进行了摸索。重组毒441-PR8的尿囊液分别按8×104、4×104、2×104、1×104、5×103TCID50/瓶接毒量接毒，吸附2 h后，加入含有0.5 μg/mL的TPCK-Trypsin的无血清培养液5 mL，接毒后24～108 h每12 h取1次培养上清，测定血凝效价，分析最佳接毒剂量和收毒时间。

2 结果

2.1 pBD-441-HA和pBD-441-NA重组质粒的鉴定分别用sapI-HA-up、sapI-HA-down 和sapI-NA-up、sapI-NA-down 为上下游引物，PCR 扩增SH441 HA和NA全片段，并用1%琼脂糖电泳检测。从图1可以看出，分别扩增出大小为1742 bp和1457 bp的特异目的条带，与预期条带大小一致。此外，测序结果表明序列完全与预期一致。

图1 PCR鉴定重组pBD-441-HA和pBD-441-NA质粒Fig.1 Identif cation of plasmids pBD-441-HA and pBD-441-NA by PCR

2.2 救获重组病毒的鉴定经血凝实验测定，救获重组病毒441-PR8株的血凝效价为29。收获尿囊液、分装并保存于-80℃冰箱备用。此外，取尿囊液提取

RNA，经RT-PCR扩增，回收PCR产物并测序。测序结果显示，救获的重组病毒HA和NA序列与母本序列完全一致。

2.3 救获重组病毒441-PR8和SH441的病毒滴度利用Reed-Muench法计算获得病毒滴度：重组病毒441-PR8株滴度为5×105.5TCID50/100 μL；SH441滴度为104.5TCID50/100 μL。

2.4 重组病毒441-PR8和野生病毒分离株在MDCK细胞上生长特性的比较结果按1000 TCID50/孔的量感染细胞，重组病毒441-PR8感染后12 h血凝价迅速升高到24，36 h就已达到28，此后基本维持在该水平。而SH441的血凝效价上升缓慢，48 h达到峰值24（见图2）。与其他7株H9N2亚型病毒株比较（图3），重组病毒441-PR8在细胞上的生长特性虽然没有达到PR8的最高滴度，但明显优于其他任何一个H9N2亚型的野生分离株。

2.5 病毒接毒量的测定将重组病毒441-PR8的鸡胚尿囊液做一系列稀释后接种到T25细胞培养瓶中，结果显示当接毒量为8×104TCID50/瓶，36 h的血凝价就已达到210，36～84 h血凝价趋于平稳，所以T25瓶的最佳接毒量为每瓶8×104TCID50，收毒时间为接毒后36 h即可（图4）。

图2 重组病毒441-PR8及SH441感染MDCK细胞后不同时间的血凝效价Fig.2 Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with reassortant inf uenza virus (441-PR8) and wild-type SH441 inf uenza virus at different hours post-infection

图3 重组病毒441-PR8及野生型H9N2禽流感病毒感染MDCK细胞后不同时间的血凝效价比较Fig.3 Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with reassortant inf uenza virus (441-PR8) and H9N2 avian inf uenza virus isolates at different hours post-infection

图4 重组病毒441-PR8在MDCK细胞上不同接毒剂量和收毒时间的血凝效价的比较分析Fig.4 Comparison of hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with different dose of reassortant inf uenza virus (441-PR8) at different hours post-infection

3 讨论

H9N2亚型禽流感病毒在全球范围的家禽和野生鸟类中流行传播，且感染宿主谱已经向哺乳动物包括人类和猪拓伸[7]。近些年分离的毒株的致病性和毒力等生物学特性趋于转强，有效疫苗的研发对于积极预防H9亚型流感病毒具有深远意义。目前我国使用的H9N2亚型禽流感疫苗均为鸡胚尿囊液制备的灭活疫苗，而利用动物传代细胞来制备流感疫苗的研究已成为流感疫苗发展的重要方向。同传统的基于鸡胚的流感疫苗制备技术相比，该方法具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定，降低生产成本，提高生产效率等优点[8]，因而成为目前流感疫苗研制工作的主要方向之一。

A/Puerto Rico/8/34 （H1N1）（PR8）毒株是一株具有高繁殖能力的鸡胚适应株，在细胞上的增值能力也很强，疫苗研制中常常将PR8的内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度[9]，这样获得的重组病毒既继承了PR8内部基因供体的生物学特性，同时还保留了流行毒株良好的免疫原性。如Shirakura等[10]采用7∶1、6∶2、和5∶3模式研制pdm09的流感疫苗候选株，Corinne等[11]将PR8∶H3N2按不同组合研制H3N2亚型流感疫苗种子，Pan等[12]利用PR8神经氨酸酶包装信号序列提高H5N1亚型候选疫苗生长滴度。前期本研究室已经构建了犬流感H3N2-PR8的重组病毒，与野生型病毒相比在鸡胚和细胞上的增值能力都很高，国内外也有很多学者研制出内部基因来源于 A/PR8/34 株的高繁殖力重组病毒。但是这些重组病毒疫苗候选株都是在鸡胚上进行大量扩增，在细胞上进行H9亚型重组病毒疫苗候选株的研究还没有见到报道。

本研究室前期制备了一系列H9N2亚型分离毒株的高免血清，通过抗原交叉反应证实了441分离株制备的血清与近些年分离的H9N2亚型病毒株有良好的交叉反应性。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株，本研究通过反向遗传操作技术将441的HA和NA基因与PR8的6个内部基因进行人工重组，拯救并获得了一株禽流感重组病毒441-PR8株。生长特性研究发现，与野生毒株441和其他7株H9N2亚型流感病毒相比，重组病毒441-PR8株在MDCK细胞上增殖速度快，短时间内就能产生较高血凝效价28，而野生毒株增殖速度较慢，SH441株当感染60 h时血凝价仅达到最大为24，重组病毒在细胞上的生长滴度是野生毒株的16倍，结果表明我们获得了1株在细胞上能快速繁殖的病毒441-PR8株，这将为今后在细胞上大量繁殖病毒进行细胞疫苗的研究奠定基础。另外，本研究也对扩大培养技术进行了初步探讨，确定了最佳接毒剂量和最佳收毒时间，为今后细胞疫苗的生产提供了技术支持。

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DEVELOPMENT OF A HIGH-GROWTH H9N2 REASSORTANT INFLUENZA VIRUS BY REVERSE GENETIC MANIPULATION ON CELLS

REN Chao-chao, TENG Qiao-yang, SHEN Wei-xia, LI Xue-song, LI Guo-xin, YANG Jian-mei, YAN Li-ping, LI Ze-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

H9N2 inf uenza viruses generally grow at high titers in chicken embryonated eggs but poorly in cell cultures. In order to obtain a H9N2 vaccine virus with high yield of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) in cell cultures, reverse genetics technique was used to develop “6+2” reassortant virus (441-PR8). The HA and NA genes of the reassortant virus 441-PR8 were derived from A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2, SH441) and the remaining six internal segments were derived from A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, PR8). The biological properties of the reassortant virus 441-PR8 were characterized. The reassortant virus 441-PR8 replicated more vigorously in MDCK cells than its parent virus SH441, suggesting that the reassortant virus 441-PR8 may represent a promising vaccine candidate for H9N2 avian inf uenza.

Avian inf uenza virus; H9N2 subtype; H1N1 subtype; reverse genetics manipulation; reassortant virus

S852.659.5

A

1674-6422（2014）02-0007-06

2014-02-28

公益性行业（农业）专项经费（201003012）；863计划（2011AA10A200）；上海市科委“创新行动计划”现代农业领域重点科技攻关项目（12391902000）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2013JB06）；国际交流与合作专项基金（2010DFB33920）

任超超，女，硕士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn；闫丽萍，E-mail：ylp@shvri.ac.cn