曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，谭 磊，孙英杰，宋翠萍，丁 铲

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

HeLa细胞中泛素蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，谭 磊，孙英杰，宋翠萍，丁 铲

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本文主要对细胞的泛素-蛋白酶体系统是否参与新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的复制过程进行了研究。用NDV感染HeLa细胞，对细胞样品进行Western blot实验，并检测细胞26S蛋白酶体的三种蛋白水解活性变化。同时使用多种泛素-蛋白酶体系统相关的抑制剂处理细胞并做NDV感染，测定细胞上清中病毒TCID50值，比较药物处理与DMSO处理对病毒增殖的影响。结果表明，HeLa细胞在感染NDV后，细胞内泛素化蛋白水平降低，而26S蛋白酶体的三种蛋白水解活性都显著升高；使用泛素-蛋白酶体系统抑制剂后NDV的增殖受到了明显的抑制，证明NDV在HeLa细胞内的增殖与细胞自身的泛素-蛋白酶体系统关系密切。

新城疫病毒；泛素-蛋白酶体系统；蛋白酶体抑制剂；复制

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽类急性高度接触性传染病，发病率高死亡率高。在OIE陆生动物卫生法典中，本病属于必须报告的A类病，世界各国对本病的发生和流行均高度重视[1]。新城疫病毒属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属，为单股负链，不分节段的RNA病毒。RNA基因组包含6个主要基因，它们以3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的顺序编码结构性蛋白和两个非结构性蛋白（W蛋白和V蛋白[2]）。该病毒能在细胞质中复制。

泛素-蛋白酶体系统包含泛素分子、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）、26S蛋白酶体和去泛素化酶。蛋白质降解过程由两部分组成，第一步通过三个连续的酶促反应将靶蛋白连接上多泛素链，即靶蛋白的泛素化，第二步即是泛素化的靶蛋白被26S蛋白酶体识别并降解[3,4]。近年来有研究发现多种病毒以各种方式利用宿主细胞的泛素-蛋白酶体系统为病毒自身的入侵、复制、出芽等服务。例如：单纯疱疹病毒、流感病毒在入侵宿主细胞的过程中需要利用泛素蛋白酶体系统[5,6]。尼帕病毒的出芽过程需要依靠泛素调节的M蛋白的核-胞质转运[7]。但是关于泛素-蛋白酶体系统是否参与了NDV的感染过程目前尚无报道。研究发现NDV感染的细胞中泛素化蛋白水平发生变化和26S蛋白酶体三种蛋白水解活性有显著变化，鉴于此，本试验使用针对泛素-蛋白酶体系统的多种抑制剂研究泛素-蛋白酶体系统在NDV感染HeLa细胞过程中所起的作用，从而加深对病毒与宿主细胞互作过程的认识，从新的角度解释NDV的致病机理。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞本试验所用病毒毒株为 NDV标准强毒 Herts/33，由扬州大学刘秀梵院士惠赠；HeLa细胞系由本研究室保存，细胞采用含 10% 胎牛血清的DMEM 培养液，常规37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.2 化学试剂蛋白酶体抑制剂MG-132购自碧云天生物公司；Bortezomib购自Selleckchem公司；Lactacystin和泛素活化酶E1抑制剂PYR-41购自Sigma公司；蛋白酶体活性检测试剂盒Proteasome-Glo购自Promega公司；泛素抗体购自Cell signaling公司。其他生化试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 新城疫病毒感染后泛素化蛋白水平检测将HeLa细胞接种至60 mm培养皿中，使用含10% FBS 的DMEM培养基在37℃细胞培养箱中培养。待细胞生长至80%～90%时，接种 5 MOI的Herts/33病毒，并在感染后的8、12、16、24 h收取细胞样品，进行Western blot，检测新城疫病毒感染后HeLa细胞中泛素化蛋白水平的变化。

1.4 新城疫病毒感染后蛋白酶体活性检测根据蛋白酶体检测试剂盒说明书将96孔细胞培养板分为4个组：①空白组、②细胞组、③Herts/33、④MG-132组。HeLa细胞以1.8×104个/孔接种至96孔细胞培养板中特定位置，细胞生长到80%左右时，弃上清，①②④组每孔加入100 μL培养基，第③组中接种5 MOI Herts/33，37℃孵育1 h后换液；在①②③组中每孔加入100 μL维持培养基，第④组中每孔加入100 μL MG-132（0.4 μmol/L），37℃继续培养12 h后加入检测试剂，用酶标仪检测发光值并计算水解活性位点活性。

1.5 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂最适工作浓度筛选根据参考文献[8～11]选择三种蛋白酶体抑制剂MG-132、Bortezomib、Lactacystin 和泛素活化酶E1抑制剂PYR-41。WST-1可以被细胞中线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的有色甲臜产物，细胞增殖越多颜色越深，通过比色法可以检测细胞活性，所以可以用WST-1法检测不同抑制剂浓度下的细胞活性[12]。用DMEM培养基将以上4种抑制剂分别稀释成6个稀释度。每孔HeLa细胞中加入100 μL抑制剂，每种抑制剂稀释度做3个重复。37℃培养50 h后每孔加入WST-1试剂10 μL，继续培养2.5 h。用酶标仪检测OD450结果，通过计算判断不同的抑制剂浓度时细胞活性情况，选择细胞活性不低于80%的抑制剂浓度为最适工作浓度。

1.6 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒增殖情况的影响

1.6.1 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒滴度的影响 根据相关文献报道[13]，将HeLa细 胞接种至35 mm培养皿，使用含10% FBS 的 DMEM培养基在 37℃细胞培养箱中培养。细胞生长至80%～90%时，将每种抑制剂都分为3种处理组：①抑制剂+Herts/33处理组；②相同稀释度的DMSO+Herts/33处理组；③Herts/33处理组。根据试验1.5中确定的4种抑制剂最适工作浓度，确定分组。首先在第①、②组中加入抑制剂或DMSO，第③组中加入培养基，都置于37℃预处理2 h后弃上清，再根据细胞计数将5 MOI Herts/33接种至培养皿，37℃培养1 h后洗去，最后在第①、②组中加入由维持培养基配置的抑制剂或DMSO，第③组中加入维持培养基，37℃继续培养至第12 h和第24 h，分别收集细胞上清测定TCID50值。

1.6.2 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒生长状况的影响 将HeLa细胞接种至 35 mm培养皿， 使用含10% FBS 的 DMEM培养基在 37℃细胞培养箱中培养。细胞生长至80%～90%时，根据细胞计数将1 MOI Herts/33接种至培养皿中，37℃培养1 h后洗去。使用0.4 μmol/L的MG-132处理细胞，同时设置无抑制剂处理的空白组，分别在病毒感染后第2、4、6、8、12、24、32、48 h收集细胞上清，检测上清中病毒TCID50值，分别绘制使用蛋白酶体抑制剂MG-132和未使用抑制剂时的Herts/33病毒在HeLa细胞上的生长曲线。

2 结果

2.1 新城疫病毒感染后泛素化蛋白水平检测本试验所用Herts/33毒株的病毒滴度为107.8TCID50/0.1mL, 5 MOI的Herts/33病毒感染HeLa后，在感染后8、12、16、24 h分别收取细胞样品，同时在每个时间点设置未感染病毒的处理组。将细胞样品裂解后与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合后，100℃水浴加热10 min，进行Western blot检测，使用针对泛素化蛋白的抗体。结果在病毒感染早期细胞内泛素化蛋白基本没有变化，感染12～16 h，细胞中的泛素化蛋白水平开始降低，而随着病毒感染加剧，在感染后24 h细胞基本完全崩解，细胞内泛素化蛋白水平也急剧下降（图1）。

2.2 新城疫病毒感染后蛋白酶体活性检测通过计算可知，在Herts/33病毒感染后HeLa细胞的蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样（chymotrypsin-like）蛋白水解活性位点活性升高158.17%，胰蛋白酶样（Trypsinlike）蛋白水解活性位点活性升高56.59% ，半胱天冬酶样（Caspase-like）蛋白水解活性位点活性升高158.59%。三种蛋白酶体水解位点活性值在抑制剂MG-132处理后都明显下降，说明该试剂盒可以灵敏检测到细胞内蛋白酶体活性的变化，该试剂盒检测结果可信（图2）。

2.3 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂最适工作浓度确定采用WST-1方法检测使用不同浓度的抑制剂MG-132、 Bortezomib、 Lactacystin 、PYR-41时，HeLa细胞的细胞活性，结果见图3。当细胞活性不低于80%时的抑制剂浓度即为最适工作浓度，所以最后选择MG-132的最适工作浓度为0.4 μmol/L，Bortezomib的最适工作浓度为20 nmol/L ，Lactacystin的最适工作浓度为20 μmol/L，PYR-41的最适工作浓度为25 μmol/L。

图1 新城疫病毒感染对Hela细胞中泛素化蛋白的影响Fig.1 The inf uence of NDV on the ubiquitinated proteins in HeLa cells

2.4 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒增殖情况的影响

2.4.1 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒滴度的影响 在用抑制剂预处理2 h后，使用5 MOI Herts/33感染细胞1 h后洗去，换上含有抑制剂的维持培养基，在病毒感染后第12 h和第24 h收取细胞上清，同时设置相同稀释度DMSO处理的对照组，以及只感染病毒的对照组，各上清的TCID50值结果见表1。在感染后第12 h，MG-132处理组的病毒滴度比其DMSO对照组的滴度降低了100.78，Bortezomib处理组的滴度比其DMSO对照组低100.18, Lactacystin处理组的滴度比其DMSO对照组低100.18，PYR-41处理组的滴度比其DMSO对照组低101.7。在感染后第24 h时，MG-132处理组的病毒滴度比其DMSO对照组低100.37，Bortezomib处理组的滴度比其DMSO对照组低100.08，Lactacystin处理组的滴度比其DMSO对照组低100.09，PYR-41处理组的滴度比其DMSO对照组低101.69。可以看出这四种泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂都可以不同程度的抑制HeLa细胞上清中病毒的滴度。

图2 新城疫病毒对HeLa细胞26 S蛋白酶体三个蛋白水解位点活性的影响

图3 三种蛋白酶体抑制剂MG-132、Bortezomib、Lactacystin和泛素活化酶E1 抑制剂PYR-41的工作浓度Fig.3 The working concentration of the three kinds of proteasome inhibitor MG - 132, Bortezomib, Lactacystin and E1 ubiquitin activating enzyme inhibitors PYR – 41

表1 四种抑制剂处理后的细胞上清TCID50值Table 1 The TCID value of the cell culture medium with the four kinds of inhibitors

2.4.2 泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对病毒生长状况的影响 细胞接种1 MOI Herts/33，在病毒感染后2、4、6、8、12、24、32、48 h分别收集细胞上清，用TCID50方法测定病毒的滴度。根据2.4.1的结果，四种抑制剂都可以抑制HeLa细胞上清中病毒的滴度，所以选取了其中代表性的一种抑制剂MG-132进行生长曲线的测定。0.4 μmol/L MG-132处理组的病毒滴度在早期就比未处理组要低，在12 h以后MG-132处理组的病毒滴度比未处理组明显降低。以时间的Log2为横轴，上清中TCID50的对数为纵轴，绘制出细胞上清中的病毒生长曲线（图4）。

图4 MG-132处理细胞后上清中病毒在不同时间的滴度Fig.4 The growth curve of Herts/33 virus in HeLa cells which were treated by MG-132

3 讨论

我们已知细胞自身的泛素-蛋白酶体系统是除溶酶体途径以外的一种重要的蛋白质降解系统，该系统在细胞调控中发挥重要作用，包括对各种细胞蛋白进行泛素化修饰（功能性泛素化）和泛素化降解，调节细胞中各种功能性蛋白、信号通路的抑制因子和（或）激活因子，使细胞进行有序的生物学活动[14]。病毒作为一类严格的细胞内寄生的生物，它如何利用宿主细胞的泛素-蛋白酶体系统为自身的入侵、复制以及释放等方面的研究逐渐受到大家的关注[15,16]。已知信号转导和转录激活因子STAT可以调控细胞因子等基因表达，其中STAT1和STAT2蛋白是Ⅰ型和Ⅲ干扰素信号通路中重要的分子，同时也是细胞抗病毒免疫中重要的组成[17]。有研究表明当细胞感染腮腺炎病毒属中副粘病毒或仅仅转染副粘病毒V蛋白时，STAT1、STAT2和STAT3蛋白可以被快速降解[18]。V蛋白与细胞中成分DDB1和Cul4组成泛素-蛋白连接酶E3，特异性识别STAT蛋白，使其通过蛋白酶体被降解，从而抑制干扰素下游抗病毒蛋白的表达，进而有利于病毒复制。这些结果在副流感病毒、腮腺炎病毒和猿猴病毒5等中均有报道[19-21]。NDV属于副粘病毒属，其V蛋白是否也可以与细胞成分构成复合物起到E3的作用还未有相关报道，所以本研究根据其他副粘病毒的研究推测新城疫病毒在细胞上的增殖也需要泛素-蛋白酶体系统的参与。

本研究通过使用泛素单抗发现当感染新城疫病毒后HeLa细胞内的泛素化蛋白在感染后期逐渐减少。我们已知26S蛋白酶体由20S核心复合物和19S调节复合物组成。20S核心复合物为桶状结构由两个α外环和两个β内环构成，两个β内环组成降解催化腔，含有三种蛋白酶底物降解催化位点：胰凝乳蛋白酶样活性位点、胰蛋白酶样活性位点和半胱天冬酶样活性位点[22]。所以同时我们又使用试剂盒检测病毒感染之后的细胞中26S蛋白酶体三个蛋白水解位点的活性变化。结果显示感染NDV之后三个蛋白水解位点的活性都显著升高，可以说明宿主细胞内的泛素-蛋白酶体系统比感染病毒之前更为活跃。综合上述实验我们确定细胞自身的泛素-蛋白酶体系统参与了新城疫病毒的感染过程。

为了进一步确定试验结果，我们使用三种蛋白酶体抑制剂MG-132、Lactacystin、Bortezomib以及泛素活化酶E1抑制剂PYR-41。蛋白酶体抑制剂通过抑制26S蛋白酶体的活性来阻断泛素化的靶蛋白被降解；而PYR-41则是从源头上抑制靶蛋白被泛素化进而抑制其K63与K48型泛素化。除了抑制剂Bortezomib毒性较大不适宜在HeLa细胞上进行实验外，其他三种抑制剂都不同程度的抑制了NDV在HeLa细胞上的增殖。因为泛素活化酶E1抑制剂PYR-41可从源头上切断泛素-蛋白酶体系统的功能，所以对病毒的复制抑制作用较其他抑制剂更明显。这表明NDV感染后不仅需要对诸如天然免疫系统中的信号分子进行降解以利于病毒复制，可能也需要其他一些细胞蛋白的功能性泛素化参与病毒复制。说明NDV在HeLa细胞内的复制与细胞自身的泛素-蛋白酶体系统关系密切。

本文确定NDV感染HeLa后，细胞中的泛素化蛋白量减少，而26S蛋白酶体活性大大增加，进而通过加入抑制剂实验确定NDV在HeLa细胞中增殖过程与细胞的泛素-蛋白酶体系统关系密切。这一研究结果将加深对病毒与宿主细胞互作过程的认识，从新的角度解释NDV的致病机理，将对发现新型抗NDV病毒药物起一定作用。

[1] 蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 4版. 北京∶ 中国农业出版社, 2001∶ 304-309.

[2] Usoff K Y, An W S T. Newcastle disease virus∶macromolecules and opportunities [J]. Avian Pathol, 2001, 30(5)∶ 439-455.

[3] Glickman M H, Ciechanover A. The Ubiquitinproteasome proteolytic pathway∶ destruction for the sake of construction[J]. Physiol Rev, 2002, 82(2)∶ 373-428.

[4] 吴慧娟, 张志刚. 泛素-蛋白酶体途径及意义[J]. 国际病理科学与临床杂志, 2006, 26(1)∶ 7-10.

[5] Delboy M G, Roller D G, Nicola A V. Cellular proteasome activity facilitates herpes Simplex virus entry at a postpenetration step [J]. J Virol, 2008, 82(7)∶ 3381-3390.

[6] Khor R, McElroy L J, Whittaker G R. The ubiquitinvacuolar protein sorting system is selectively required during entry of influenza virus into host cells [J]. Traffic, 2003, 4(12)∶ 857-868.

[7] Wang Y E, Park A, Pentecost M L,et al. Ubiquitinregulated nuclear-cytoplasmic trafficking of the Nipah virus matrix protein is important for viral budding[J]. PLoS Pathog, 2010, 6(11)∶ 1-17.

[8] Yu G, Lai M M C. The Ubiquitin-Proteasome system facilitates the transfer of murine Cornavirus from endosome to cytoplasm during virus entry [J]. J Virol, 2005, 79(1)∶ 644-648.

[9] Neznanov N, Dragunsky E M, Chumakov K M,et al. Different effect of proteasome inhibition on vesicular stomatitis virusand poliovirus replication [J]. PLoS ONE, 2008, 3(4)∶ 1-12.

[10] Schubert U, Ott D E, Chertova E N,et al. Proteasome inhibition interferes with Gag polyprotein processing, release, and maturation of HIV-1 and HIV-2[J]. Proc Natl Acad Sci U S, 2000, 97(24)∶ 13057-13062.

[11] Fernandez-Garcia M, Meertens L, Bonazzi M,et al. Appraising the roles of CBLL1 and the ubiquitin/proteasome system for flavivirus entry and replication [J]. J Virol, 2011, 85(6)∶ 2980-2989.

[12] Ngamwongsatit P, Banada P P, Panbangred W,et al.WST-1-based cell cytotoxicity assay as a substitute for MTT-based assay for rapid detection of toxigenic Bacillus species using CHO cell line[J]. J Microbiol Methods, 2008, 73(3)∶ 211-215.

[13] Widjaja I, Vries E D, Tscherne D M,et al. Inhibition of the Ubiquitin-Proteasome system affects Influenza A virus infection at a postfusion step [J]. J Virol, 2010, 84(18)∶ 9625-9631.

[14] 赵天锁, 任贺, 郝继辉. 泛素-蛋白酶体通路的研究进展[J]. 山东医药, 2009, 49(32)∶ 113-114.

[15] Gao G, Luo H. The Ubiquitin-proteasome pathway in viral infections [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2006, 84(1)∶5-14.

[16] Harrison M S, Schmitt P T, Pei Z,et al. Role of ubiquitin in Parainfluenza virus 5 particle formation [J]. J Virol, 2012, 86(7)∶ 3474-3485.

[17] AuYeung N, Mandhana R, Horvath C M. Transcriptional regulation by STAT1 and STAT2 in the interferon JAKSTAT pathway[J]. JAK-STAT, 2013, 2(3)∶ 1-8.

[18] Ulane C M, Kentsis A, Cruz C D,et al. Composition and assembly of STAT-Targeting ubiquitin ligase complexes∶ Paramyxovirus V protein carboxyl terminus is an oligomerization domain [J]. J J Virol, 2005, 79(16)∶10180-10189.

[19] Andrejeva J, Poole E, Young D F,et al. The p127 Subunit (DDB1) of the UV-DNA damage repair binding protein is essential for the targeted degradation of stat1 by the v protein of the Paramyxovirus simian virus 5 [J]. J Virol, 2002, 76(22)∶ 11379-11386.

[20] Ulane C M, Horvath C M. Paramyxoviruses SV5 and HPIV2 assemble STAT Protein ubiquitin ligase complexes from cellular components [J]. Virology, 2002, 304(2)∶ 160-166.

[21] Ulane C M, Rodriguez J J, Parisien J,et al. STAT3 ubiquitylation and degradation by Mumps virus suppress cytokine and oncogene signaling [J]. J Virol, 2003, 77(11)∶ 6385-6393.

[22] 邱小波, 王琛, 王琳芳. 泛素介导的蛋白质降解[M]. 北京∶ 中国协和医科大学出版社, 2008∶ 315-318.

EFFECT OF UBIQUITIN-PROTEASOME SYSTEM ON NEWCASTLE DISEASE VIRUS REPLICATION IN HELA CELLS

QU Yu-rong, ZHAN Yuan, QIU Xu-sheng, TAN Lei, SUN Ying-jie, SONG Cui-ping, DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the present study was to examine the effect of cellular ubiquitin-proteasome system on Newcastle disease virus (NDV) replication in Hela cells. To determine whether ubiquitin-proteasome system was activated in NDV infected HeLa cells, cellular samples were taken at indicated times for Western blot and for measurement of chymotrypsin-, trypsin- and caspase-like activities. Additionally, NDV infected HeLa cells were treated with different inhibitors of ubiquitin-proteasome system and virus titers (TCID50) in culture supernatants were determined. A significant increase in 26S proteasome activity was observed after NDV infection while ubiquitinated proteins decreased. The application of inhibitors signif cantly reduced NDV production and delayed viral propagation. In conclusion, ubiquitin-proteasome system plays a critical role in NDV replication in HeLa cells.

Newcastle disease virus; ubiquitin-proteasome system; proteasome inhibitor; replication

S852.659.5

A

1674-6422（2014）02-0013-07

2014-01-28

863计划项目（2011AA10A209）；国家自然科学基金项目（31101822）；公益性行业（农业）科研专项经费（201303033）

曲昱蓉，女，硕士研究生，预防兽医学专业

丁铲，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn