兰金荣，叶文斌

（陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃 成县 742500）

黄瑞香（Daphne giraldii nitsche）为瑞香科植物，主要分布于陕西、甘肃、四川、青海，生于海拔1 600 m山地。茎皮及根皮入药，能止痛、散血、补血，其茎皮和根皮为祖师麻药材的来源之一，祖师麻辛、苦、温，有小毒，归肝经。黄瑞香还可以作为纯中药制剂注射液，临床上用于消炎镇痛疗效显著，对风湿和类风湿性疼痛疗效很好，对癌症晚期的止痛效果亦较满意，而且黄瑞香注射液与甲氨喋呤有同等疗效[1]。其主要含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类等成分[2]。其中瑞香素（祖师麻甲素）为其指标成分之一[3-4]，由其开发的制剂有祖师麻片、祖师麻注射液、黄瑞香注射液、祖师麻膏药、祖师麻关节止痛膏等，临床和制剂使用量很大，但由于其药用部位为皮部，采收主要以毁灭性的方式进行，不但对主产地植被造成严重破坏，而且对其种质资源的保护也受到了严重的威胁。为节约药用植物材料，减少资源浪费，开发所含其它活性成分。目前，关于黄瑞香提取物对植物病原菌抑菌活性的研究还未见报道。本试验利用黄瑞香提取物对小麦病原菌进行深入研究，以研发出新型的抗植物病原菌制剂，为丰富植物源的生防制剂品种、合开发利用小麦病害防治以及植物源农药开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄瑞香采自甘肃省陇南市成县。供试植物病原菌为小麦赤霉病病原菌(Fusarium graminearumSchw.)、小麦根腐病原菌(Helminthosporium sorokinanumSacc.)、小麦纹枯病原菌(Rhizoctonia cerealisVander Hoeven)，这3种病原菌均购自甘肃农业大学农学院，病原菌培养基为PDA培养基。

1.2 方法

1.2.1 黄瑞香提取物制备 将黄瑞香全株洗去表面杂质，剪成1 cm的小段自然阴干后，以不同溶剂、不同提取时间、不同提取温度、不同料液比、不同溶剂浓度，水浴回流提取3次，之后用循环式真空泵进行抽滤，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩得膏状物，50℃真空干燥，研磨即得到提取物粉末，保存于4℃的冰箱中待用。

1.2.2 病原菌活化

保存的菌种接种与PDA斜面，25℃恒温培养，然后接种到含PDA培养基的培养皿中培养，第7天进行抑菌实验。

1.2.3 提取物抑菌活性测定 取黄瑞香提取物粉末用水配成25 mg/mL供试液。取配制的供试液0.5 mL于灭菌的10 mL试管中，加入9.5 mL 50℃左右的PDA培养基，摇匀，倒入灭菌培养皿中后，选取长势整齐的菌落圈，以打孔器制得菌饼，并挖出孔内培养基，倒置于上述加药培养基的平皿上，每皿3个。28℃恒温倒置培养43 h。用十字交叉法量取菌落圈直径，取其平均值作为试验结果，计算抑制率[5-6]。同时以蒸馏水为对照（CK）。

抑制率＝对照菌落直径－处理菌落直径对照菌落直径×100%。

参考美国临床检验标准委员会(NCCLS)的推荐标准，以抑菌圈直径＞20 mm为极敏，抑菌圈直径在15～20 mm为高敏，抑菌圈直径在10～14 mm为中敏，抑菌圈直径＜10 mm为低敏，无抑菌圈为耐药，测定滤纸片的抑菌圈直径，结果取平均值。

1.2.4 最低抑菌浓度的确定 采用2倍稀释法[5-6]，以1%Tween-80为溶剂，取20 mg/mL黄瑞香提取物供试液，配制成1、1/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256等不同稀释度的溶液，取各个浓度药液1 mL分别加入到无菌培养皿中，再加入经灭菌处理并冷却至50℃左右的9 mL营养琼脂培养基(真菌用PDA培养基)，充分混匀后冷却制成含样液平板，接种培养，观察结果，与对照组（CK）(菌落正常生长)比较，肉眼可见菌落生长者为无抑制作用，以完全没有菌落生长的最小质量浓度为其MIC[7-9]，以1%Tween-80为溶液作对照。

1.3 数据分析

所有实验数据用SPSS17.0统计软件进行统计，用单因素方差结合SSR多重比较分析检验显著性（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂对小麦病原菌抑菌活性比较

称取一定量黄瑞香提取物粉末，加入5倍体积的水、75%甲醇和75%乙醇，50℃水浴回流提取1 h，提取3次，测定不同提取溶剂对小麦病原菌菌丝生长的抑制作用。从表1可以看出，在黄瑞香提取物供试质量浓度为25 mg/mL时，对3种供试小麦病原菌，抑制菌丝效果最佳的均为75%乙醇提取液，且小麦赤霉病病原菌和小麦纹枯病原菌抑制率均达到40%以上。

表1 不同提取溶剂对3种小麦病原真菌菌丝生长的抑制作用比较 %

2.2 不同提取时间对小麦病原菌抑菌活性比较

称取一定量黄瑞香提取物粉末，加入5倍体积的75%乙醇溶液，50℃水浴回流分别提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取3次，测定不同提取时间对3种供试小麦根腐病原菌菌丝生长的抑制作用。从表2可以看出，在提取物质量浓度为25 mg/mL时，不同提取时间对小麦纹枯病原菌原菌和小麦根腐病原菌菌丝的抑制作用影响较大；但是对小麦赤霉病菌原菌抑制效果相对较差。但提取0.5 h时，对小麦3种病原菌菌丝的抑制效果都相对较差，1 h以上抑制效果较好，且二者之间差异显著。

表2 不同提取时间对3种小麦病原真菌菌丝生长的抑制作用比较 %

2.3 不同提取温度对小麦病原菌抑菌活性比较

称取一定量黄瑞香提取物粉末，加入5倍体积的75%乙醇溶液，以40、50、60、70和80℃的不同温度水浴回流提取1 h，提取3次，测定不同提取温度对3种供试小麦根腐病原菌菌丝生长的抑制作用。从表3可以看出，在提取物质量浓度为25 mg/mL时，提取温度对小麦纹枯病原菌、小麦根腐病原菌和小麦赤霉病菌菌丝的抑制作用影响明显，抑制率均达到50%以上；对小麦赤霉病菌病原菌，提取温度60℃以下的提取物抑菌效果相对较差，提取温度在70℃以上的提取物抑菌效果较好，而小麦纹枯病原菌和小麦根腐病原菌在80℃提取物抑菌效果较好。结果表明，75%乙醇和甲醇提取物的抑菌效果较好，水提取物的抑菌效果最差，这说明黄瑞香中主要抑菌活性成分是醇溶性物质。通过不同溶剂、不同提取时间、不同提取温度提取物对植物病原菌的抑菌效果比较，确定了黄瑞香抑菌活性物质的提取条件，75%乙醇、70℃以上提取，温度和提取1 h以上效果较佳，可得到的总体抑菌效果较好的黄瑞香提取物。

表3 不同提取温度对3种小麦病原真菌菌丝生长的抑制作用比较 %

2.4 最佳提取条件下黄瑞香提取物对小麦病原菌抑菌活性比较

抑菌实验结果如表4所示，在75%乙醇、70℃以上提取温度和提取1 h以上的条件下，可得到总体抑菌效果较好的黄瑞香提取物对小麦纹枯病原菌和小麦赤霉病菌原菌的抑制作用均表现为极敏，对小麦根腐病原菌表现为中敏。

表4 黄瑞香干燥叶片挥发油抑菌效果

2.5 最佳提取条件下黄瑞香提取物对供试菌的MIC

据表5实验结果选择研究最佳条件下所得的黄瑞香提取物对供试菌的MIC，采用2倍稀释法进行测定。由表5可知，黄瑞香提取物对不同供试菌具有不同的抑菌效果，对小麦纹枯病原菌原菌和小麦赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC为1/256；对小麦根腐病原菌MIC均为1/128。

表5 黄瑞香干燥叶片水蒸汽蒸馏挥发油的MIC

2.6 温度对黄瑞香提取物抑菌效果的影响

最佳条件下所得的黄瑞香提取物经80、100、120和150℃处理15 min后，对各供试菌的抑菌效果见表6。可以看出，经过不同温度加热处理，提取物对3种供试细菌抑菌效果的影响不大，各处理温度之间抑菌圈的差异不明显。因此，可以说明黄瑞香在提取溶剂75%乙醇、提取温度70℃和提取时间为1 h以上所得提取物的抑菌活性成分具有较好的热稳定性。

表6 黄瑞香提取物不同温度加热处理后对各种供试菌的抑菌效果

3 结论

黄瑞香在提取溶剂75%乙醇、提取温度70℃和提取时间为1 h以上所得提取物的抑菌活性较好。对小麦纹枯病原菌原菌和小麦赤霉病菌原菌的抑制作用均表现为极敏，对小麦根腐病原菌表现为中敏。所得提取物对小麦病原真菌的MIC有差异，其中对小麦纹枯病原菌原菌和小麦赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC为1/256；对小麦根腐病原菌MIC均为1/128。而且具有良好的热稳定性，经80、100、120和150℃处理15 min后，其抑菌活性无明显变化。虽然最佳提取工艺所得提取物对小麦病原真菌具有较好的抑菌效果，但具体的提取优化工艺还有待进一步优化。黄瑞香中起抑菌效果的具体化学成分以及黄瑞香中的抑菌成分是某种成分单独起作用还是几种同时起协同作用都有待进一步研究。若能从黄瑞香中提取抑菌活性成分作为生物农药，并且将其直接用于农业植物病害的防治，将会极大地提高黄瑞香的有效利用率，并可减轻环境压力，为农药安全生产提供更优的选择，所以研究结果为进一步开发利用黄瑞香全株提供实验依据。

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