胡长伟 尹港峰 王希瑞 白庆龄 吕艳明 赵文清 李文玲

IL-24是一种新发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，系IL-10家族成员。IL-24是一种具有细胞因子特性和抑瘤因子功能双重功效的蛋白质。正常生理浓度的IL-24可能是调节免疫反应，而在超生理浓度下会显示非常好的抗肿瘤特性。目前认为IL-24发挥抑癌作用主要是通过调节肿瘤细胞的凋亡信号通路促进肿瘤凋亡。但对于IL-24具体抑制肿瘤细胞凋亡的机制尚不明确。本文通过荧光定量PCR及免疫组化技术初步探讨IL-24可能通过蛋白激酶(PKR)、真核细胞翻译起始因子(eIF-2α)影响胶质瘤细胞凋亡。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年1月至2009年12月沧州市中心医院神经外科手术切除胶质瘤标本肿瘤组30例，所有胶质瘤标本均进行HE染色，常规病理检查并按WHO 2007年脑肿瘤分类标准分类:Ⅰ～Ⅱ级9例;Ⅲ级11例均为间变性星形细胞瘤;Ⅳ级胶质母细胞瘤10例。其中，男18例，女12例;平均年龄(43±19)岁。正常脑组织对照组标本均来自外伤患者内减压手术，共7例。

1.2 检测方法

1.2.1 荧光定量 PCR:将胶质瘤组织及细胞中的RNA提取后，经分光光度仪检测与定量(要求OD260/OD280比值为1.8～2.0)。反转录后加入GAPDH、IL-24或PKR、eIF-2α的引物后置于7300 HT荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR完成后，在ABI 7300 System SDS Software SDS1.3.2.10 软件上分析，并计算基因相对表达量。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 免疫组化:将胶质瘤及正常脑组织标本石蜡包埋切片用作检测其中IL-24及PKR、eIF-2α的表达。标本切片常规脱蜡脱水后，一抗(IL-24和PKR、eIF-2α抗体购自美国Promega公司)以1∶100浓度4℃孵育24 h，PBS替代一抗作为阴性对照。然后二抗以1∶100浓度(购自美国Sigma公司)37℃孵育30 min。应用ABC法和DAB显色，苏木素复染，封片后显微镜下检测。从染色反应阳性细胞数及阳性强度两方面进行综合判断评分。评分标准:无阳性细胞为0分，＜20%为1分，20% ～39%为2分，40% ～69%为3分，＞70%为4分。染色强度以多数细胞为准，评分标准:染色阴性0分，淡棕黄色1分，深棕黄色2分，深棕褐色3分。将阳性细胞百分率与染色强度二者得分相加得到总积分，取每个标本3张切片总积分的均值，作为该标本研究指标的平均表达值，用于统计分析。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-24在胶质瘤组织中的表达 用荧光定量PCR和免疫组化的方法检测各标本中IL-24 mRNA及蛋白的表达情况，发现胶质瘤中IL-24表达较正常脑组织明显降低，且随胶质瘤级别的增加，其表达逐渐降低。见图1。

图1 免疫组化检测IL-24、PKR、eIF-2α在各级别胶质瘤中的表达

2.2 PKR、eIF-2α在胶质瘤组织中的表达 应用荧光定量PCR和免疫组化的方法检测各标本中PKR、eIF-2α的 mRNA及蛋白的表达情况，发现PKR、eIF-2α在胶质瘤中的表达较正常脑组织明显降低，也随胶质瘤级别的增加，其表达逐渐降低。见图2。

图2 荧光定量PCR检测各级别胶质瘤中IL-24、PKR、eIF-2α的mRNA的表达

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤。胶质瘤呈浸润性生长，无明显界限，目前多采用以手术为主，结合放疗、化疗的综合治疗。而临床治疗中手术很难完全切除，化疗和放疗既不能高度特异性地杀伤胶质瘤细胞，治疗效果差，又可能产生中枢神经系统，乃致全身不能耐受的毒、副作用。目前研究发现IL-24可以选择性杀伤许多肿瘤细胞(包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等)，而不损伤正常细胞［1－3］。IL-24 是目前研究较广泛的一种肿瘤抑制因子，其在多种肿瘤中的抗癌特性已被验证。胶质瘤的发生发展与多种细胞因子的异常表达有关，目前认为胶质细胞中抑癌基因的突变会造成抑癌因子表达的下调或缺失，从而引发一系列的细胞信号通路的改变，并最终引发细胞的癌变，成为胶质瘤细胞。最近，Yacoub 等［4，5］研究发现IL-24可发挥一定的胶质瘤细胞抑制作用，并提高胶质瘤细胞的放疗易感性。但目前关于IL-24与人脑胶质瘤发生发展的关系及IL-24对胶质瘤作用的具体机制尚不明确。本研究发现在胶质瘤中IL-24的表达降低，且胶质瘤恶性程度越高，IL-24表达越低，与胶质瘤恶性程度相关，说明IL-24的表达对胶质瘤可能有一定的抑制作用。

我们还发现胶质瘤组织中PKR的表达比正常脑组织明显降低。PKR是一种调节细胞凋亡的蛋白分子，目前发现PKR的活化可介导多种肿瘤细胞的凋亡增加，从而发挥抗肿瘤特性［6］。PKR即双链RNA依赖性蛋白激酶，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是干扰素所介导的抗病毒以及促使细胞凋亡功能的主要调解因子之一，它参与多种刺激因子所介导的凋亡［7］。PKR基因定位于人染色体2p21-2，PKR基因是由一个含有许多潜在调控元件的启动子所转录，通过两个双链RNA绑定区域被激活［8］。激活的PKR可以调控多个下游靶位，其中包括 eIF-2α，NF-κB，可以抑制蛋白的合成，最后抑制细胞的生长和促进细胞凋亡［9－12］。我们发现胶质瘤组织中PKR、eIF-2α的表达比正常脑组织明显降低，与IL-24相同的随胶质瘤级别的增加而降低。说明IL-24的表达与胶质瘤的恶性程度有关，并且IL-24可以通过调控PKR、eIF-2α的表达，进而影响胶质瘤细胞的凋亡。

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6 Jagus R，Joshi B，Barber GN.PKR.apoptosis and cancer.Int J Biochem Cell Biol，1999，31:123-138.

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8 Lee SB，Esteban M.The interferon induced double stranded RNA activated protein kinase induces apoptosis.Virology，1994，199:491-496.

9 Saelens X，Kalai M，Vandenabeele P.Translation inhibition in apoptosis:caspase-dependent PKR activation and eIF2-α phosphorylation J Biol Chem，2001，276:41620-41628.

10 Sudhakar A，Ramachandran R，Ghosh S，et al.Phosphorylation of serine 51 in initiation factor 2α(eIF2α)promotes complex formation between eIF2α(P)and causes inhibition in the guanine nucleotide exchange activity of eIF2B.Biochemistry，2000，39:12929-12938.

11 Der SD，Yang YL，Weissman C，et al.A dsRNA-activated protein kinase-dependent pathway mediating stress-induced apoptosis.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:3279-3283.

12 Freidrich I，Ben-Bassat H，Levitzki A.Activation of dsRNA dependent protein kinase PKR in Karpas 299 does not lead to cell death.Cancer Biol Ther，2005，4:734-739.