张淑莉，李素芬

（1.西安医学院医学技术系检验中心，陕西 西安 710021；2.陕西省地方病研究所，陕西 西安 710003)

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

张淑莉1，李素芬2

（1.西安医学院医学技术系检验中心，陕西 西安 710021；2.陕西省地方病研究所，陕西 西安 710003)

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的简便方法。方法以无血清的RPMI1640培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。通过细胞形态学观察，台盼蓝染色计数细胞活力，瑞氏染色计算纯度，细胞吞噬墨汁颗粒测定其吞噬率，鉴定这些细胞是巨噬细胞。结果本实验获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简便的巨噬细胞体外分离培养方法。

小鼠；巨噬细胞；分离培养；鉴定

巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成分，它在抗感染、抗肿瘤和免疫调节中起着非常的重要作用[1-2]。巨噬细胞来源于骨髓，它在机体中分布广泛，主要分布于肝、脾、淋巴结、骨髓、胸腺、胸腔、腹腔、血液、皮肤等多种组织器官。如何从这些组织器官中分离、纯化获得高纯度、高活性的巨噬细胞，如何选择适当的细胞提取及鉴定方法是体外细胞培养研究工作者的首要任务。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定的简便方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器RPMI1640培养液，10%胎牛血清，瑞氏染液，台盼蓝染液，印度墨汁，二氧化碳培养箱，倒置显微镜，TDL湘仪离心机。

1.2 实验动物由第四军医大学实验动物中心于2013年10月份提供雌性健康小鼠20只，6～8周龄，体重18～22 g。

1.3 小鼠分离、培养将小鼠颈椎脱臼法处死，用70%酒精消毒小鼠腹部皮肤，然后让其仰卧位四肢展开，固定于解剖板上，无菌条件下打开小鼠腹腔，用眼科镊提起下腹皮肤，剪一小口，并沿腹中线剪开3～5 cm长的腹部皮肤，充分暴露腹膜，向腹腔注射预冷的不含小牛血清的RPMI1640培养液5 ml，注意进针勿过深，不要损伤内脏及血管，轻柔腹部约2～3 min，静置5 min后用镊子提起腹膜，用吸管吸取腹腔灌洗液，并重复灌洗一次。将两次回收的的灌洗液4℃离心，所得细胞沉淀用预冷RPMI1640培养液洗涤，1 000 r/min离心10 min两次，弃去上清，将沉淀细胞再加入预冷RPMI1640培养液(青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml和10%胎牛血清)重悬细胞。以常规方法计数细胞，用预冷培养液调整腹腔细胞浓度至2×106/ml，然后将细胞悬液接种于24孔培养板中，1 ml/孔，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，使巨噬细胞贴壁。孵育2～4 h后换液，取出培养板，用RPMI1640培养液漂洗1～2次，弃去非粘附的其他细胞，获得贴壁细胞即为单层的巨噬细胞。取少量细胞悬液作台盼蓝染色检测细胞活性、并作瑞氏染色。

1.4 巨噬细胞的观察与鉴定

1.4.1 培养细胞形态学检查细胞培养后每日用显微镜观察细胞形态变化及生长状况。

1.4.2 台盼蓝染色[3]取巨噬细胞悬液0.5 ml，滴加等量0.4%台盼蓝染液置于Eppendorf管中，混匀，取一滴染色的细胞悬液滴加入牛鲍计数板中，静置2～3 min待细胞下沉后，将计数板置显微镜下计数：在3 min内分别计数死细胞、活细胞，并用活细胞占计数细胞的百分比表示其活力。

1.4.3 瑞氏染色[4]计算细胞纯度取细胞悬液1滴加于洁净载玻片上，制备涂片，自然干燥，瑞氏染色后将干燥好的涂片置光学显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片体尾交界处细胞薄厚分布及染色情况，再用油镜计数细胞。

1.5 细胞吞噬功能的检测细胞培养5 d(120 h)后行墨汁吞噬试验[5]，在培养体系中加入10%滤纸滤过的优质印度墨汁50μl继续培养3 h后取出盖玻片，用等渗液洗去游离的墨汁颗粒，晾干，瑞氏染色，油镜(10× 100倍)下计数200个巨噬细胞，巨噬细胞胞浆中吞有大小墨粒5个以上的为阳性细胞，计算吞噬百分率，每张涂片计数时应重复3次取平均值。吞噬百分率=阳性细胞数/200个吞噬和未吞噬的巨噬细胞×100%。

2 结果

2.1 活细胞形态观察培养24 h后用倒置显微镜可观察到贴壁细胞形态多样，呈圆形或椭圆形、梭形、不规则形，细胞体积较大，胞浆丰富，培养1周时细胞表面伸出许多刺毛状小突起(伪足)。

2.1.1 台盼蓝染色正常存活的细胞能够排斥台盼蓝染料进入细胞，使活细胞不着色，呈无色透明状，有折光性。当细胞坏死等造成细胞膜完整性丧失后，染料弥散进入细胞中将死细胞染成明显的蓝色。显微镜下可区分死细胞、活细胞，本次实验巨噬细胞的成活率达98%以上。

2.1.2 瑞氏染色在瑞氏染色下，在油镜(10× 100倍)下可见细胞形态多样，胞浆丰富，富含颗粒及少许空泡。多为单核，呈卵圆形、肾形或不规则形，多偏于一侧，着色深，细胞有突起和伪足，从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度＞98%。

2.2 细胞吞噬功能结果吞噬了墨汁颗粒的巨噬细胞经瑞氏染色后胞体呈圆形或不规则形，胞质中有大量大小不等的黑色墨汁颗粒，胞核形态不规则并有明显扭曲折叠。细胞吞噬试验，显示巨噬细胞对墨汁颗粒有很强的吞噬作用，吞噬百分率为96%。

3 讨论

巨噬细胞属细胞免疫，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞能表达数十种受体，可产生数十种酶并能分泌近百种生物活性产物。巨噬细胞承担着吞噬、消除细胞内寄生虫、真菌和消除衰老的自身细胞的功能，它在特异性体液免疫和细胞免疫中都有重要作用，所以巨噬细胞的吞噬消化功能，在一定程度上可作为衡量机体免疫系统功能状态的一个重要指标。由于巨噬细胞具有较强的吞噬功能，检测巨噬细胞吞噬功能对于判断巨噬细胞的功能，了解机体的特异性和非特异性免疫状态有重要作用。巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于原发性和继发性吞噬功能缺陷、胃癌、肠癌等多种肿瘤患者，也可作为考核治疗效果及作为判定肿瘤复发、转移的简易指标。

本实验获得的细胞经形态学观察，细胞形态多样，胞浆丰富，富含颗粒及少许空泡。多为单核，呈卵圆形、肾形或不规则形，多偏于一侧，着色深，有突起和伪足，具有体内巨噬细胞的形态特征。提取细胞后进行台盼蓝染色、瑞氏染色进行细胞鉴定，可获得高纯度＞98%、高活性的巨噬细胞。本实验检测巨噬细胞体外吞噬功能主要采用墨汁吞噬实验显示细胞的吞噬率为96%，说明培养贴壁巨噬细胞具有良好的吞噬能力。

综上所述，对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外诱导，培养后在短时间内获得大量贴壁生长细胞，通过形态学观察，细胞活力测定、瑞氏染色、体外吞噬功能检测，证实所培养贴壁细胞是高纯度、高活性的巨噬细胞，与文献报道一致[6]。此种测定方法操作较为简便，且重复性较好，易于获得足量的巨噬细胞，是一种快速实用的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞体外分离培养的简便方法，可广泛应用于临床及实验研究。

[1]徐远义,黄允宁,常越,等.多抗甲素诱导小鼠腹腔巨噬细胞对+癌细胞杀伤增强机制的研究[J].免疫学杂志,2006,22(4)∶396-398.

[2]黄琼,李志,杨杏芬,等.流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[J].中国药理学与毒理学杂志,2007,21(2)∶140-146.

[3]黄蓓.细胞与组织培养[M].北京∶人民卫生出版社,1999∶48-49.

[4]郑天林,彭明婷,谷小林,等.外周血细胞形态学检验及技巧[D].卫生部.2004∶32-33.

[5]谢锦玉.现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用[M].北京∶中医古籍出版社,1998∶24-26.

[6]高鹏,石磊,张润玲.小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴定方法探讨[J].中国医学检验杂志,2004,5(5)∶400-402.

Separation,cultivation and identification of mouse peritoneal macrophages.

ZHANG Shu-li1,LI Su-fen2.1.Testing Center,Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2. Endemic Disease Research Institute of Shaanxi province,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo establish a convenient method of separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages.MethodsAbdominal cavity were douched using RPMI1640 mediun without serum,were isolated and obtained mouse peritoneal macrophages,and the cells were cultured in RPMI1640 mediun with 10%fetal bovine serum.The cells were identified by morphological observation,trypan blue staining,Wright's staining and phagocytosis.ResultsIn this experiment,the obtained were highly purified macrophages with morphologic characteristics Of the macrophage in organism,favourable phagocytosis.ConclusionThis was a simple and pragmatic method for separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages.

Mouse;Macrophages;Isolation and cultivation;Identification

R-332

A

1003—6350（2014）19—2814—02

2014-04-26)

西安医学院质量工程检验实验示范中心（编号：XYZL2010-18）；西安医学院校级科研基金大学生科研项目（编号：11DXS11）

张淑莉。E-mail：zhangshuli2006@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1109