孙璐，韦立新

（中国人民解放军总医院病理科，北京 100853）

弥漫大B细胞淋巴瘤预后生物标志物的进展

孙璐，韦立新

（中国人民解放军总医院病理科，北京 100853）

弥漫大B细胞淋巴瘤是一种异质性肿瘤，捕获与患者预后相关的分子和蛋白标志物，建立生物标志物预后模型来预测患者的不良结局和进行风险分层，对更好地管理患者和指导治疗十分重要。

弥漫大B细胞淋巴瘤；预后；生物标志物

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)最常见的一种类型，占西方国家成人NHL的30%～40%。肿瘤具有异质性，在基因改变、临床特征、形态学表现、对治疗的反应和预后等方面存在着差异[1]。DLBCL的标准治疗方案，如R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)诱导的完全缓解率超过75%。然而目前的长期无事件生存率为50%～60%，而30%～40%的患者最终死于肿瘤[2]。捕捉反映肿瘤异质性的预测指数，识别无法从现有治疗获益的DLBCL患者，能够更好地管理患者和指导风险调整后的治疗策略[3]。国际预后指数评分(International Prognostic Index，IPI)为DLBCL患者的管理提供预后指导，易于实施，是最重要的临床预后评估工具之一。即使在利妥昔单抗时代仍是对DLBCL患者进行危险度分层的最有价值的工具。可是，IPI评分并不能完全代表疾病的异质性，即使IPI评分相同的患者预后也存在很大差异[4]。因此，疾病的侵袭性和肿瘤进展的差异与明显的基因和分子异质性相关。从而，学者们将重点转移到与患者预后相关的分子和基因标志物的研究，以期建立某种模型来预测DLBCL患者的不良结局和进行风险分层，从而允许在高风险人群中试验新的治疗方法是否能够改善预后，并且保证研究人群中不会混有那些从标准治疗中获益的患者[5]。本文就国内外文献中报道较多的生物标志物，尤其是继基因表达谱分型(Gene expression profiling，GEP)后提出的一系列以免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)方法模拟基因分型的新的生物预后模型做一综述。

1 单个预后标志物

淋巴瘤的恶性细胞出现遗传学和表观遗传学的累加变化，导致异常的基因活性和免疫表型，多条信号通路出现异常，使得瘤细胞持续增殖、逃避凋亡、不受抑制增殖和分化信号的调控、侵袭性生长和促进血管生成。以上过程中的任意特殊分子的变化都可能成为肿瘤治疗的选择靶点和与预后相关的标志物[6]。参与细胞循环的调控分子有TP53、p27KIP1、CyclinD和Ki-67，抑制细胞凋亡的蛋白有Survivin、BCL2和Caspases。在B细胞不同分化阶段发生肿瘤转化而形成的DLBCL，表现出细胞表面和细胞内蛋白异质性表达、免疫球蛋白基因不同状态的突变，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且这些癌基因标志物与患者预后相关。粘附分子主要参与炎症部位淋巴细胞的回家和迁移，除正常生理功能外，还在肿瘤侵犯和转移过程中发挥作用。细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和CD44阳性表达的DLBCL患者预后不良。血管生成是指从肿瘤外部的血管生成新的毛细血管，是肿瘤生长超出几立方毫米的必须步骤，在成人受到多种促进或抑制血管生长的调节蛋白的严格调控。外周血检出高水平Endostatin或血管内皮生长因子(VEGF)的患者预后差。恶性肿瘤细胞外基质过度破坏、新生血管密度增加和肿瘤扩增与缺乏基质金属蛋白酶(MMP)相关。其他的单个分子预后标志物还有nm23-H1、IL-10、肝细胞生长因子(HGF)和主要组织相容复合物分子。上述单个生物标志物的研究提供了IPI之外的有价值的预后信息，丰富了我们关于淋巴瘤生长病理学机制的知识，但是大量的研究产生了矛盾的结果，不能得出统一的结论。其原因一方面在于多数研究是回顾性研究，存在固有的问题。另一方面，肿瘤的生长是复杂的生物学过程，涉及多个基因、多种信号通路和调节机制，单个基因或分子预测预后的能力有限，不能准确反映恶性肿瘤的异质性。

2 与肿瘤细胞起源相关的GEP分型和相应的免疫组化分型方法

本世纪初，随着基因芯片技术的运用，Alizadeh等[7]和Rosenwald等[8]根据GEP将DLBCL分为生发中心B细胞样亚型(Germinal center B cell-like，GCB)、与外周血活化B细胞具有类似基因表达特点的外周血活化B细胞样亚型(Activated B cell-like，ABC)以及第3型(type 3，特点无法界定)。其中，GCB亚型预后较好，而ABC亚型与第3型预后相似且明显差于GCB亚型，故归为一类即非生发中心亚型(non-GCB)。GCB组和non-GCB组的5年生存率分别为76%和16%，差异有显著统计学意义，这种差异在不同IPI组之间也依然存在。现阶段，因GEP技术复杂、价格昂贵、需要新鲜组织等因素不利于临床推广应用，所以很多病理学家研究在DLBCL病例中利用免疫组织化学技术模拟基因芯片，对石蜡包埋的组织进行分型，从而推测肿瘤细胞来源和预测临床结局。

已经报道的多种分型方法中，Hans、Choi和Tally法均来自美国Nebraska大学医学中心[9-11]。研究者以GEP分型为金标准，分别对CHOP和R-CHOP治疗后的DLBCL患者的肿瘤组织芯片(Tissue microarray，TMA)进行不同IHC分型方法与GEP分型一致性的比较，其中Tally法与GEP分型的一致率达93%，被认为一致性最好，Choi法和Hans法的一致率分别为87%和86%。三种IHC分型方法的敏感性和特异性均较好，并且GCB组患者的预后均优于non-GCB组。Hans法最早被提出，目前在临床应用最为广泛，该分型法选择了一组与GCB和non-GCB分型高度相关的IHC抗体作为套餐(包括CD10、BCL-6和MUM1)，并被写入2008年WHO淋巴造血系统肿瘤分类。有学者针对CHOP治疗患者的研究证实了Hans等的发现[12-13]，但是一些研究未能发现Hans分型后的GCB和non-GCB两组间预后有显著差异[14-16]。李敏等[15]的研究认为在Hans法的抗体套餐外增加GCET1和FOXP1的Choi法分型与预后显著相关。有趣的事，Nyman等[12]还发现，Hans法分型与R-CHOP治疗后DLBCL患者的预后显著相关，GCB组预后更好，这与Mayer等[11]的发现相符合。Natkunam等[14]进一步提出以单一的抗体LMO2作为研究因素，结果发现无论是CHOP治疗组还是R-CHOP治疗组，LMO2阳性表达组患者无进展生存和总体生存明显优于LMO2阴性组，差异有统计学意义，提示LMO2蛋白表达同LMO2的mRNA表达一样，对DLBCL患者有预后意义，并且不受治疗方式的影响。但是Natkunam法分型与GEP分型的一致性最差。Nyman等[12]选用MUM1和FOXP1两个代表活化B细胞的标记，只要有一个阳性表达就划分为活化B细胞亚型，结果发现活化B细胞组较其他病例组的预后差。Muris等[17]选择CD10、MUM1和BCL-2为IHC套餐对DLBCL进行危险度分层，提示结合了GCB与non-GCB及凋亡蛋白的分组较单纯的仅区分细胞来源和仅比较细胞凋亡的分组更能有力预测患者预后，尤其是在高IPI组。尽管Nyman法和Muris法与GEP分型的一致率达到81%和77%，但是前者敏感性过低，而后者特异性较差[11]。Mayer等[11]在Choi法基础上加入LMO2，作为CD10、GCET1、MUM1和FOXP1后仍无法明确分型时的权重因子，提出新的Tally分型方法；还进一步验证，全部的分型方法都可以将患者分成总体生存和无事件生存不同的两组，但每种分型方法的风险比值不同。除了Nyman法，通过其他方法划分的亚型是独立于IPI的生存预测因子。

造成各种IHC研究结果不一致的原因，既有生物学因素，又有技术因素。前者是与患者和治疗相关的特征，如患者人群的异质性和不同的治疗药物，后者包括染色的差别、TMA切片与整块组织切片的差别、组织固定、一抗的差异和数据计分的主观性。在上述各方法中使用的抗体中，BCL-6染色和计数的重复性最差。CD10阳性率低是导致Hans法将GEP分型中的GCB亚型错分为non-GCB亚型的原因之一。

3 考虑肿瘤微环境影响的GEP研究结果和相应的免疫组化分型方法

Rosenwald等[8]的研究定义了4种基因印迹，它们在DLBCL中发挥不同生物学作用，与CHOP治疗后的患者生存相关。“生发中心B细胞”印迹提示预后好，与GCB样和ABC样分型平行。“增殖”印迹提示预后差，包括MYC及其目标基因。“主要组织相容复合物Ⅱ”印迹在DLBCL部分亚群的肿瘤细胞中沉默，与预后差相关。“淋巴结”印迹提示预后好，反映了肿瘤微环境的性质，包括细胞外基质成分。由此可见，除肿瘤细胞外，DLBCL背景中非肿瘤细胞的类型和数量，即肿瘤微环境，也发挥着重要的作用，决定患者的预后[18]。最近，Lenz等[19]运用GEP技术研究发现，DLBCL肿瘤微环境中非肿瘤细胞的不同组成成分及其特征可以预测患者的预后，尤其是编码细胞外基质成分的基因的表达与临床结局有关。他们命名了两个重要的基质印迹Stromal-1和Stromal-2。Stromal-1反映细胞外基质的沉积和单核组织细胞的浸润，预示良好结局；而Stromal-2很大程度上反映了肿瘤间质的血管生成和血管密度，预示不良结局。细胞外基质包括纤维粘连蛋白、骨粘连蛋白(SPARC)、多种胶原和层粘连蛋白Isoforms和抗新生血管因子Thrombospondin。Meyer等[20]用抗SPARC抗体模拟Stromal-1印迹来评估DLBCL微环境中基质细胞和组织细胞的表达，结果显示肿瘤基质中SPARC阳性表达组比阴性组有更长的生存期，二者差异具有统计学意义。Brandt等[21]发现联合表达基质标记物纤维粘连蛋白和SPARC的DLBCL患者总生存期更长。Cardesa-Salzman等[22]通过测量DLBCL中的微血管密度模拟Stromal-2印迹，提示微血管密度高是预后差的相关因素。

随后，有学者又在上述研究肿瘤微环境组成成分差异对DLBCL预后影响的基础上，结合以往的以肿瘤细胞为主体的分型，提出了一个综合性的新的生物预后模型[23]。该模型中以non-GCB细胞样亚型，SPARC阳性细胞＜5%和微血管密度四分位数为4作为预后差的因素，每一个预后差的因素计1分。研究发现：生物计分低(0～1分)的组预后好，而生物计分高(2～3分)的组预后差；提示这一新的生物预后模型可以与IPI评分一起用于DLBCL的危险度分层，并据此开展新的或风险适应性治疗。Alizadeh等[24]也认为，通过分别测定一个反映肿瘤细胞来源的基因(LMO2)和一个反映肿瘤微环境的宿主细胞的基因(TNFRSF9)可以有力地预测DLBCL患者的预后。

4 小结

依据不同生物标志物设定的免疫分型方法，对DLBCL患者预后的影响尚存在争议。尤其是Hans分型方法，虽然目前应用较普遍，但在Hans等[9]认为预后较好的GCB类型中，同样存在着少部分预后差的病例，不同的研究小组在免疫分型与预后相关性方面的研究结果也存在着分歧。同时本文中综述的各种生物标志物是否适用于中国人群，尤其是新的结合肿瘤细胞来源与微环境影响的综合性生物标记物模型，是少数西方研究者针对本地区病例研究后所得，国内尚未见报道。综上所述，有必要在国内多个中心开展有关DLBCL的多种生物标志物的深入研究，发现那些与中国DLBCL患者预后相关的标志物，为认识中国人群相关疾病特征和开展有针对性的治疗提供理论依据。

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Research progress of prognostic biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma.

SUN Lu,WEI Li-xin.Department of Pathology,PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

Diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)is a heterogenous group of neoplasm.The discovery of specific genetic alterations and the assessment of protein expression lead to the identification of molecular markers capable of predicting the outcome of DLBCLpatients independently of clinical variables and finding better therapeutic target.

Diffuse large B-cell lymphoma;Prognosis;Biomarker

R733.4

A

1003—6350（2014）19—2879—04

2014-05-23)

韦立新。E-mail：73887391@qq.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1132