王湘芸，钱玲玲(综述)，王如兴，李肖蓉(审校)

(南京医科大学附属无锡市人民医院心内科，江苏 无锡 214023)

大电导钙离子激活钾通道即BK通道，也称Slo或MaxiK通道，广泛存在于血管平滑肌细胞膜上，对血管张力调节起重要作用[1]。冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压和糖尿病等许多病理状态下BK通道功能受损，进而影响血管舒缩功能[2]。研究表明,BK通道受许多化学物质的影响[3-5]。该文就腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的作用予以综述。

1 BK通道的结构和特点

1981年,Malty[6]在牛嗜铬细胞上首先发现BK通道，其单通道电导为100～300 pS，且激活受细胞外钙离子浓度的影响，故称为大电导钙离子激活钾通道。

BK通道由α和β两种亚基构成，呈四聚体，α亚基包括与细胞膜外N端相连的7个跨膜片段(S0～S6)以及位于细胞膜内与C端相连的4个疏水性片段(S7～S10)，其中S1～S4构成电压敏感区域，S5、S6及P环构成通道结构[7]。S7、S10区域包含两个与钙有高亲和力的结合区域“钾电导调节元件结构域”和“钙碗”，它们分别位于S7和S10结构域，是决定BK通道钙离子敏感性的关键结构(图1)。

α亚基主要构成BK通道结构，β亚基则对BK通道具有调节作用，β亚基有四种亚型，分别是β1、β2、β3和β4，β亚基包含两个具有胞外环的跨膜区域TM1和TM2，TM1与细胞内N端相连，靠近α亚基的S1和S2，TM2与细胞内C端相连，靠近α亚基的S0，它们在对α亚基的调节中起非常重要的作用，可提高BK通道的电压依赖性和钙敏感性[8]。β亚基中不同亚型在各组织器官的表达水平各不相同，在血管平滑肌细胞中主要是β1亚型，β2和β4亚型表达水平较低，甚至难以测出[2]。

图1 大电导钙离子激活钾通道结构模式图

BK通道具有电压依赖性和钙敏感性的特点，电压依赖性是指当细胞跨膜电位增加时，BK通道开放概率增加；钙敏感性是指细胞内钙离子浓度升高后，BK通道激活增加，细胞内钙离子浓度增加可由细胞内钙库释放引起，也可通过电压门控性L-型钙通道开放，钙内流所致，激活BK通道所需细胞内钙浓度至少为10 μmol/L[9]。BK通道开放后钾离子外流，细胞膜超极化，导致电压依赖性钙通道关闭，钙内流减少，血管舒张。反之，BK通道关闭或开放减少可导致细胞膜去极化，从而使电压依赖性钙通道开放，钙离子内流增加，血管收缩。研究发现，BK通道与多种介导细胞外钙内流和细胞内钙库释放的离子通道有关，如可通过细胞膜瞬时受体电位C1通道和内质网上ryanodine受体等介导细胞外钙离子内流和内质网钙释放，从而激活平滑肌细胞BK通道[10-11]。因此，细胞内钙离子浓度的变化可以直接影响BK通道的开放，而研究显示ATP可通过相应受体调节细胞内钙离子浓度[12]。

2 ATP及其受体

ATP作为人体最直接的供能物质广为人知，但是对ATP的认识经历了一个较长的过程。自1929年发现ATP至今已将近一个世纪，20世纪50年代，Pamela等首次证实感觉神经末梢能释放ATP[13]；70年代，Burnstock等提出“嘌呤神经”的概念[14]，自此ATP作为一种神经递质逐渐为人所知。但ATP的作用机制一直是研究的热点，20世纪90年代早期，人们发现ATP可使神经元去极化，膜片钳实验显示ATP能激活离子通道，还可以在周围和中枢神经系统之间介导突触传递[15-16]。进一步研究表明，ATP主要通过嘌呤受体介导发挥作用，并把ATP受体分为两大家族，促代谢型P2Y受体和离子型P2X受体，这两种受体广泛存在于机体的组织和细胞[17]。

2.1P2X受体 P2X受体是一种非选择性阳离子通道，对钙离子有较高的通透性，在哺乳动物P2X受体有7种亚型，每种亚型由一个细胞外功能区、细胞内N端和C端及两个疏水性跨膜结构组成[18]。N端长度较短，由25个氨基酸构成，而C端根据P2X亚型不同，氨基酸为30～215个，并包含蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化位点，同时也是P2X受体重要的调节区域[19]。细胞外功能区由大约280个氨基酸构成[20]。其中包括由10个保守半胱氨酸残基组成的一系列二硫键，其作用是对离子通道与ATP结合位点的耦合形成结构上的限制[21]。跨膜区域包括TM1和TM2两部分，两者共同组成P2X的通道结构[22](图2)，其中TM2的功能尤为突出[13]。

图2 P2X(左)和P2Y(右)受体结构模式图

2.2P2Y受体 P2Y受体是一种G蛋白偶联受体，在哺乳动物已克隆出P2Y(1、2、4、6、11-14)8种亚型。P2Y受体由308～379个氨基酸构成，含有7个跨膜结构域，其中N端在细胞外，C端在细胞内[21]。与P2Y受体结合的G蛋白，以α、β、γ三聚体的形式存在于细胞膜内侧，其中α亚基具有与受体结合并受其活化调节及与下游效应分子相互影响的作用。异源三聚体G蛋白是直接接收G蛋白偶联受体信号的分子，可影响许多下游效应分子和调节细胞功能。P2Y受体的细胞内C端含有一些蛋白激酶结合位点或磷酸化作用位点的共有序列，7个跨膜结构域中TM3、TM6、TM7的一些碱性残基参与配体的结合和调节，可能是兴奋性受体激活的关键[19,21]。

与P2X受体相同，P2Y受体的8种亚型也广泛分布于机体的组织和细胞。在结肠末端平滑肌细胞P2Y1和P2Y6含量较多，神经胶质细胞主要有P2Y4和P2Y6，在肠神经元主要有P2Y2和P2Y12，而在免疫活性细胞中检测到大量的P2Y4受体[22]。之后人们发现，在主动脉平滑肌细胞和肠系膜动脉平滑肌细胞都有大量的P2Y受体(1、2、4、6)[23]。近年来免疫组织化学研究显示，P2Y1在冠状动脉内皮和平滑肌上均有表达[24]。磷酸吡哆醛-6-偶氮苯-2′，4′-二磺酸对P2Y1有很强的拮抗作用，但对其他P2Y受体的作用很小甚至没有[19，25]。

3 ATP对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的影响及机制

早在1996年，Strøbaek等[26]在人类冠状动脉平滑肌细胞发现ATP可以通过嘌呤受体(P2X和P2Y)刺激细胞内钙库释放钙，从而使BK通道开放，并通过膜片钳实验予以证实。近年来，进一步研究表明，ATP主要通过与P2X受体和P2Y受体结合而发挥作用。

TM1和TM2之间的胞外结构有3个ATP的结合位点，每2～3个ATP可以激活一个P2X受体[18]。ATP与之结合，激活P2X受体，使TM构成的通道结构打开，从而引起钙离子内流，使细胞内钙浓度升高，这一机制并不依赖于第二信使的产生和扩散，因此速度较快，通常在10 ms内[21]。当钙浓度升高超过10 μmol/L时即可激活BK通道[9]。钙离子在细胞内的积聚还可以导致蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ等一些细胞内激酶激活，故P2X受体激活可能远比单纯的离子内流复杂[19]。

P2X受体有7种亚型，在机体中广泛分布。免疫荧光实验结果显示，P2X1主要分布于动脉平滑肌层，其表达量依赖动脉血管床的多少，但在冠状动脉难以检测；P2X4分布在所有动脉中，尤其是在冠状动脉和脑动脉中表达量最高；P2X7主要分布在动脉外膜，而P2X(2、3、5和6)在动脉中表达极少[27]。因此，可以推断在冠状动脉平滑肌细胞ATP主要通过与P2X4的结合发挥作用。

P2X4受体作为P2X受体的一种亚型，受许多核苷酸类似物的激活，各种类似物对P2X4受体的激活反应如下：ATP>苯甲酰苯甲酸>2-亚甲基硫ATP>胞苷三磷酸>α,β亚甲基ATP，且这种作用效果在人体有类似表现[20]。另一方面，许多物质可抑制P2X4受体，其抑制反应如下：5-(3-溴苯基)-1，3-二氢-2H-苯并呋喃并[3,2-C]-1,4-二氮杂-2-酮>帕罗西汀>三氮ATP>磷酸吡哆醛-6-偶氮苯-2′，4′-二磺酸，其中5-(3-溴苯基)-1，3-二氢-2H-苯并呋喃并[3,2-C]-1,4-二氮杂-2-酮是P2X4受体的特效抑制剂[28-29]。

P2Y受体主要通过第二信使发挥作用，P2Y受体亚型不同，其机制也各有差异。根据G蛋白亚型的不同，发现P2Y(1、2、4、6和11)受体属于Gq蛋白偶联亚群，P2Y(12～14)受体属于Gi蛋白偶联亚群[19]。前者(P2Y11除外)主要通过Gq与磷脂酶C偶联，产生肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1，4，5-triphosphate,IP3)发挥作用，后者主要通过Gi与腺苷酸环化酶耦合发挥作用，而P2Y11受体则两种机制兼有[23]。

P2Y1受体作为Gq亚群中的一员，主要分布在冠状动脉平滑肌细胞上，通过与磷脂酶C偶联，产生IP3发挥作用。研究显示，激活IP3受体不仅可以使细胞内钙离子浓度升高，还可以增加BK通道对钙离子的敏感性，使BK通道易于激活[30]。ATP为P2Y非选择性激动剂，可激活P2Y1受体，从而激活BK通道[31]。

ATP引起细胞内钙离子浓度升高是通过激活P2Y受体使细胞内IP3敏感钙库释放钙离子增加，还是通过激活P2X受体引起细胞外钙内流增加，或两者兼有，目前仍有争议。细胞内钙库包括ryanodine 敏感性钙库和IP3 敏感性钙库，在对鼠黄体颗粒细胞内钙调节研究显示，ATP诱导的细胞内钙动员受ryanodine受体的调节[32]。对鼠嗅上皮足细胞研究同样显示，ryanodine受体和IP3受体都参与G蛋白偶联受体(包括P2Y受体)引起的细胞内钙升高[33]。对细胞内钙离子转导机制研究则排除了ATP通过ryanodine受体的作用，ATP对细胞内钙浓度的影响无ryanodine受体参与[34]。

ATP激活P2X和P2Y后，两者可单独发挥作用，也可相互协调。对肾动脉平滑肌细胞的研究表明，激活P2X受体可引发IP3受体介导的细胞内钙释放[35]。但在冠状动脉平滑肌细胞是否有相同现象尚不完全清楚，还有待进一步探索。

4 结 语

ATP可以通过激活P2X受体和P2Y受体改变细胞内钙离子浓度，其中前者主要通过改变细胞膜对钙离子的通透性实现，后者主要通过磷脂酶C-IP3通路实现。细胞内钙离子浓度升高又可以促进BK通道的开放，从而使冠状动脉平滑肌细胞舒张，起到扩张血管的作用。在冠状动脉硬化性心脏病、高血压和糖尿病等病理条件下，BK通道功能受损，ATP对BK 通道的激活作用可能会发生变化，因此，深入研究ATP对病理条件下冠状动脉平滑肌细胞BK通道的作用机制，可为ATP在临床应用提供一定的理论依据，临床意义重大。

[1] Wang RX,Chai Q,Lu T,etal.Activation of vascular BK channels by docosahexaenoic acid is dependent on cytochrome P450 epoxygenase activity [J].Cardiovasc Res,201l,90(2):344-352.

[2] Hu XQ,Zhang L.Function and regulation of large conductance Ca2+-activated K+channel in vascular smooth muscle cells[J].Drug Discov Today,2012,17(17/18):974-987.

[3] Hoshi T,Tian Y,Xu R,etal.Mechanism of the modulation of BK potassium channel complexes with different auxiliary subunit compositions by the omega-3 fatty acid DHA[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(12):4822-4827.

[4] Wolin MS.Reactive oxygen species and the control of vascular function [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,296(3):H539-H549.

[5] Li M,Chang S,Yang L,etal.Conopeptide Vt3.1 preferentially inhibits BK potassium channels containing beta4 subunits via electrostatic interactions[J].J Biol Chem,2014,289(8):4735-4742.

[6] Malty A.Ca-dependent K channels with large unitary conductance in chromaffin cell membranes[J].Nature,1981,29l(5815):497-500.

[7] Ma Z,Lou XJ,Horrigan FT.Role of charged residues in the S1-S4 voltage sensor of BK channels[J].J Gen Physiol,2006,127(3):309-328.

[8] Liu G,Zakharov SI,Yang L,etal.Locations of the beta1 transmembrane helices in the BK potassium channel[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(31):10727-10732.

[9] Fakler B,Adelman JP.Control of K(Ca) channels by calcium nano/microdomains[J].Neuron,2008,59(6):873-881.

[10] Kwan HY,Shen B,Ma X,etal.TRPC1 associates with BK(Ca) channel to form a signal complex in vascular smooth muscle cells[J].Circ Res,2009,104(5):670-678.

[11] Jackson-Weaver O,Osmond JM,Riddle MA,etal.Hydrogen sulfide dilates rat mesenteric arteries by activating endothelial large-conductance Ca2+-activated K+channels and smooth muscle Ca2+sparks[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2013,304(11):H1446-H1454.

[12] Grol MW,Pereverzev A,Sims SM,etal.P2 receptor networks regulate signaling duration over a wide dynamic range of ATP concentrations[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 16):3615-3626.

[13] Khakh BS,North RA.Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS[J].Neuron,2012,76(1):51-69.

[14] Khakh BS,Burnstock G.The double life of ATP[J].Sci Am,2009,301(6):84-90,92.

[15] Jahr CE,Jessell TM.ATP excites a subpopulation of rat dorsal horn neurones[J]Nature，1983，304(5928):730-733.

[16] Benham CD,Tsien RW.A novel receptor-operated Ca2+-permeable channel activated by ATP in smooth muscle[J].Nature，1987，328(6127)：275-278.

[17] Edwards FA,Gibb AJ,Colquhoun D.ATP receptor-mediated synaptic currents in the central nervous system[J].Nature，1992，359(6391)：144-147.

[18] Rokic MB,Stojilkovic SS,Vavra V,etal.Multiple roles of the extracellular vestibule amino acid residues in the function of the rat P2X4 receptor[J].PLoS One,2013,8(3):e59411.

[19] Köles L,Gerevich Z,Oliveira JF,etal.Interaction of P2 purinergic receptors with cellular macromolecules[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2008,377(1):1-33.

[20] Coddou C,Yan Z,Obsil T,etal.Activation and regulation of purinergic P2X receptor channels[J].Pharmacol Rev,2011,63(3):641-683.

[21] Volonté C,D′Ambrosi N.Membrane compartments and purinergic signalling:the purinome,a complex interplay among ligands,degrading enzymes,receptors and transporters[J].FEBS J,2009,276(2):318-329.

[22] Burnstock G.Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission[J].Physiol Rev,2007,87(2):659-797.

[23] Volonté C,Amadio S,D′Ambrosi N，etal.P2 receptor web:complexity and fine-tuning[J].Pharmacol Ther,2006,112(1):264-280.

[24] Bender SB,Berwick ZC,Laughlin MH,etal.Functional contribution of P2Y1 receptors to the control of coronary blood flow[J].J Appl Physiol, 2011,111(6):1744-1750.

[25] von Kugelgen I.Pharmacological profiles of cloned mammalian P2Y-receptor subtypes[J].Pharmacol Ther,2006,110(3):415-432.

[26] Strøbaek D,Christophersen P,Dissing S,etal.ATP activates K and Cl channels via purinoceptor-mediated release of Ca2+in human coronary artery smooth muscle[J].Am J Physiol,1996,271(5Pt1):C1463-C1471.

[27] Lewis CJ,Evans RJ.P2X receptor immunoreactivity in different arteries from the femoral,pulmonary,cerebral,coronary and renal circulations[J].J Vasc Res,2001,38(4):332-340.

[28] Donnelly-Roberts D,McGaraughty S,Shieh CC,etal.Painful purinergic receptors[J].J Pharmacol Exp Ther,2008,324(2):409-415.

[29] Nagata K,Imai T,Yamashita T,etal.Antidepressants inhibit P2X4 receptor function:a possible involvement in neuropathic pain relief[J].Mol Pain,2009,5:20.

[30] Zhao G,Neeb ZP,Leo MD,etal.Type 1 IP3 receptors activate BKCa channels via local molecular coupling in arterial smooth muscle cells[J]. J Gen Physiol,2010,136(3):283-291.

[31] 柴松岭，高璐，张福胤.P2Y及P2Y2受体的研究进展[J].中外医疗，2009，28(14):169-171.

[32] Morales-Tlalpan V,Arellano RO,Dιaz-Munoz M.Interplay between ryanodine and IP3 receptors in ATP-stimulated mouse luteinized-granulosa cells[J].Cell Calcium,2005,37(3):203-213.

[33] Hegg CC,Irwin M,Lucero MT.Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium[J].Glia,2009,57(6):634-644.

[34] 刘益龙，杨晨，赵莉莉，等.三磷酸腺苷引起大鼠三叉神经节胞内钙离子信号转导机制的研究[J].安徽医科大学学报，2012，47(2)：112-114.

[35] Povstyan OV,Harhun MI,Gordienko DV.Ca2+entry following P2X receptor activation induces IP3 receptor-mediated Ca2+release in myocytes from small renal arteries[J].Br J Pharmacol,2011,162(7):1618-1638.