凤 权， 魏安静， 侯大寅, 武丁胜

(1. 安徽工程大学 纺织面料安徽省高校重点实验室， 安徽 芜湖 241000；2. 安徽工程大学 安徽省电气传动与控制重点实验室， 安徽 芜湖 241000)

粘杆菌素又名多粘菌素E(Polymyxin E)、克里斯汀(Colistin)等，对革兰氏阴性菌有很好的抗菌效果，几乎无残留，是最安全的兽用抗生素之一[1-2]。膜分离技术是迅速发展的现代分离浓缩技术，操作条件温和，无需添加试剂，尤其适用于易变性的热敏性物质的分离纯化[3]。笔者在前期的研究中，曾经利用陶瓷膜对粘杆菌素进行微滤处理，并利用聚醚砜(PES)超滤膜对发酵液进行超滤处理，取得良好的效果[4-5]。

静电纺丝技术是制备纳米纤维的有效途径[6-10]。本研究采用静电纺丝制得聚丙烯腈(PAN)纳米纤维，再通过化学改性在纳米纤维表面引入偕胺肟基团制成偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)纳米纤维，将AOPAN纳米纤维膜作为分离层，构建膜分离系统，对粘杆菌素发酵液进行膜分离处理，以期在确保良好滤过效果的基础上，利用AOPAN纳米纤维膜的高孔隙率和亲水性有效提高膜的通量与抗污染能力。论文中，系统分析了AOPAN纳米纤维膜对粘杆菌素发酵液的分离性能，为纳米纤维应用于抗生素发酵液后处理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

聚丙烯腈(PAN，Mw=79100 g/mol)，购于Sigma-Aldrich公司；N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、盐酸羟氨、考马斯亮蓝(G-250)购于国药化学试剂有限公司；试验中所有药品皆为分析纯，使用前未经进一步纯化。

实验用粘杆菌素发酵液(经过预处理)：发酵液由安徽皖北药业股份有限公司提供，经过硫酸酸化，pH值约5.0，再经陶瓷膜(管式，0.2 μm 孔径)微滤预处理，效价为8.25×104U/mL，蛋白质含量：53 mg/100 mL，吸光度为0.358。

比表面积及孔径测试仪(金埃谱，F-sorb2400)；MSC300杯式过滤杯(杯体为有机玻璃)，购于上海摩速科学器材有限公司；自制静电纺丝装置(主要包括注射器、注射泵、高压直流电源、纳米纤维收集装置)。粘杆菌素效价测定所需的器材见《中华人民共和国药典》(2005版)，附录ⅪA (抗生素抗生素微生物鉴定法)

1.2 实验方法

1.2.1AOPAN纳米纤维的制备

将干燥后的PAN粉末溶解到DMF 中，连续搅拌至完全溶解，制得质量百分比10%的纺丝液。将纺丝液加入到容量为20 mL的注射器中(配备内径为0.7 mm的不锈钢针头，并磨平)，高压直流电源正极与注射器的针头连接，用铝箔接收纳米纤维(接收板与地线相连)。纺丝电压设置为18 kV，纺丝接收距离为18 cm，纺丝液的喷射速度设置为1.2 mL/h。连续收集36 h后，将纤维膜于真空干燥箱中40 ℃干燥。

将制得的PAN 纳米纤维膜(约0.2 g/份)加入到100 mL pH值为7.0浓度为0.5 mol/L 的盐酸羟氨水溶液中(酸碱度用碳酸钠溶液调节)，在70 ℃下反应3 h。反应结束后，用去离子水洗涤纳米纤维至中性后于40℃真空干燥，以备用。用氰基的转化率来体现胺肟化反应进行程度，具体按照文献[11]计算。

1.2.2 膜分离装置的构建

为分析不同厚度的纳米纤维膜的过滤性能，分别将单层、两层、三层AOPAN纳米纤维膜叠合作为分离膜(经测定，纳米纤维膜的BET比表面积为20.4 m2/g, 孔体积为0.04 mL/g, 平均孔径为 12.6 nm；单层纳米纤维膜的面密度约2.5 mg/cm2)。膜分离设备结构示意图如图1所示，将单层或叠合的多层分离膜放置于过滤器的杯体和底座之间，以尼龙导流网作为支撑层，用不锈钢卡箍固定。

1.2.3 分离膜厚度的选择及膜分离性能研究

图1 基于纳米纤维膜分离装置结构示意图

1—滤料入口; 2—氮气入口; 3—纳米纤维膜；4—尼龙导流网; 5—滤过液出口; 6—经微滤处理后的粘杆菌素发酵液。

研究中，分别测定不同层数的AOPAN纳米纤维膜的渗透通量，每次操作时间为160 min；压力设置为0.1 MPa；磁力搅拌器的转速设置为150 rad/min。根据测试结果，选择适宜的分离膜层数。以经过陶瓷膜微滤预处理的粘杆菌素发酵液作为待过滤液，发酵液的微滤预处理与我们前期的研究方法相同[4]。膜通量用单位时间内通过单位膜面积的溶液体积来表示通量，具体见式1。

(1)

式中：J—通量(L/m2·min)；

V—滤过液的体积(L)；

S—膜的有效面积(m2)；

t一操作时间(min)

在研究膜的通量的过程中，同时测定蛋白质的截留率和透过液中粘杆菌素的含量(粘杆菌素A分子量为1169，粘杆菌素B分子量为1155)，在保证蛋白质较高截留率的基础上，兼顾生产效率，选择最适膜层数。透过液中蛋白质的截留率按式2计算：

(2)

式中，R—蛋白质的截留率；

C0—发酵液(经过预处理)中蛋白质的浓度 (mg/mL)；

Cp—滤过液中蛋白质的浓度 (mg/mL)

另外，为探讨操作压力对膜分离性能的影响，将膜分离的操作压力从0.04 MPa开始，每5 min提高0.02 MPa，直至升高到0.16 MPa，研究操作压力对纳米纤维膜的通量和对蛋白质、色素等杂质截留率的影响。

上述几项实验过程中，每当过滤杯中发酵液浓缩8倍后将排出，并重新补充预处理后的发酵液。考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量[12]；粘杆菌素生物效价按照药典规定的“二剂量法”来测定[13]；滤过液吸光度利用紫外可见发光光度计在470 nm处测得(蒸馏水作为空白)。

2 结果与讨论

2.1 纳米纤维膜厚度对膜渗透通量的影响

将不同层数的AOPAN纳米纤维膜在相同的压力(0.1 MPa)条件下测定其渗透通量，平行实验3次，计算标准差。实验结果如图2。

图2 不同纳米纤维膜的渗透通量(操作压力为0.1MPa)

可以看出，单层和双层纳米纤维膜维持较高的渗透通量，三层纳米纤维膜的渗透通量大幅下降。式(3)可以用于分析研究纳米纤维膜通量与浓差极化之间的关系。

(3)

式中，J—膜的渗透通量，k—传质系数，cw—膜表面浓差极化层溶质浓度，c0—溶液的溶质浓度。

3种纳米纤维膜随着操作时间的延长，其膜通量都在逐渐下降，这主要由于随着膜分离过程的进行，部分蛋白质、色素、胶体等吸附在纳米纤维膜表面，并逐渐形成浓差极化层[14]。

根据纳米纤维膜的渗透通量结果，利用式4可计算出膜通量的衰减系数。

Jt=J1·t-m

(4)

式中，Jt，J1—分别为纳米纤维膜运行t小时和1小时后的通量 (L/m2.min)、t—系统运转时间(h)、m—膜通量衰减系数。

表1不同厚度纳米纤维膜的通量衰减系数

从表1可以看出，在同样的条件下，随着纳米纤维膜层数的增加，其通量衰减系数也逐渐增大，当层数达到三层的时候，通量衰减系数大幅上升。衰减系数小，将有助于纳米纤维膜的稳定运行。

2.2 纳米纤维膜厚度与膜分离性能的关系

对不同层数的AOPAN纳米纤维膜在相同的压力(0.1 MPa)条件下得到的滤液成分进行分析。实验结果见图3和表2。

图3 纳米纤维膜对发酵液蛋白质的截留率(操作压力为0.1MPa)

将160 min内收集的滤液进行分析，得出其蛋白质截留率及吸光度数值，具体见表2。

表 2 不同纳米纤维膜的蛋白质平均去除率及滤液吸光度

根据实验结果可以看出，不同厚度的纳米纤维膜对蛋白质的截留率有较大差异，在相同操作条件下，叠合的纤维膜达到2层以上时，体现出良好的蛋白质截留性能。通过对滤过液的生物效价测定，粘杆菌素均能通过上述3种不同厚度的纳米纤维膜，对得率不造成损失。

透光度主要体现滤液中杂质和色素的多少，会影响最终产品的纯度。结果表明，滤过液的吸光度是随膜厚度的增大而减小，膜厚为两层时，吸光度已经低于0.2，该数据优于用PES超滤膜的处理结果 (与PES超滤膜相比，两层叠合纳米纤维膜的渗透通量也有大幅提高)[5]，这意味着更多的杂质被纳米纤维膜截留，最终粘杆菌素产品将会有更高的纯度。

综合分析纳米纤维膜的渗透通量、衰减系数，以及滤过液的蛋白质截留率和吸光度可得出，双层叠合的纳米纤维膜过滤性能理想、过程稳定，具有潜在的实际应用价值。

2.3 操作压力与纳米纤维膜分离性能的关系

操作压力不仅是影响纳米纤维膜渗透通量的重要因素，其对膜分离性能也有影响。对于膜分离装置而言，在运行过程中，既需要保证对蛋白质、色素等杂质较高的截留率，又要尽量提高其处理效率。实验中，利用双层叠加的AOPAN纳米纤维膜对粘杆菌素发酵液进行膜分离，在不同的操作压力下，测定纳米纤维膜的渗透通量以及蛋白质的截留率。

图3 操作压力对纳米纤维膜分离性能的影响

可以看出，在膜分离的初期阶段，压力较低，膜的渗透通量也较低，此时的过滤阻力主要来自于膜本身；随着操作压力的逐渐加大，膜的渗透通量也迅速增加，也加快了纳米纤维膜表面凝胶层的形成，并逐渐出现浓差极化现象，通量增加幅度变缓；当压力达到0.14 MPa时，增加的压力几乎都被凝胶层阻力所抵消。另外，当压力大于0.14 MPa以后系统变的不太稳定，当压力大于0.16 MPa后，纳米纤维膜出现破损。

实验同时测定了在不同的操作压力下纳米纤维膜对蛋白质截留率。结果表明，在整个膜分离过程中，操作压力对蛋白质截留率没有显著影响。综合上述实验结果，选择0.14 MPa作为该膜分离系统的最适操作压力(该阶段滤过液的蛋白质含量为5.32 mg/100 mL，通量为2.61 L /m2.min，吸光度为0.189)。

3 结论

本文经过静电纺丝及化学改性制得直径为纳米尺度的AOPAN功能性纳米纤维，并在此基础上构建膜分离系统，用于粘杆菌素发酵液的后处理。通过对不同厚度的纳米纤维分离膜的传质及分离性能对比，确定双层叠合的AOPAN纳米纤维膜为适宜厚度。实验结果同时表明，基于双层AOPAN纳米纤维的分离膜具有较高的渗透通量，对发酵液中的蛋白质和色素等杂质有良好的截留性能，而对粘杆菌素的得率不造成影响。本文还同时研究量在不同操作压力下，纳米纤维膜的通量变化和分离效果，结果表明，0.14 MPa为最适操作压力，在此条件下，纳米纤维膜的通量为2.61 L/m2.min，蛋白质的截留率达到90%，吸光度降为0.189，色素等其他杂质也得到有效去除。该研究为纳米纤维应用于抗生素发酵液后处理提供实验依据。

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