董玉稳， 汤 斌， 李 松， 张莹莹， 李祥林

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，芜湖 241000)

纤维素酶是一类能将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用来分解纤维素成寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖[1]。可广泛应用于能源、食品、饲料、造纸、洗涤、纺织、印染、酿酒等多个行业[2]。纤维素酶系是一个复杂的酶系，主要由3类不同功能的酶组成：内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH)和β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶，BG)。内切葡聚糖酶可随机水解β-1, 4糖苷键，将长链纤维素截断，生成不同长度的纤维素短链，为外切葡聚糖酶提供反应末端；外切葡聚糖酶可作用于纤维素链的末端，依次从纤维素链上切下纤维二糖；β-葡萄糖苷酶主要将纤维二糖水解成葡萄糖，也可以从可溶性纤维寡糖的非还原端切下葡萄糖[3]。现在普遍认同的一种丝状真菌对纤维素降解模型是：真菌能够分泌少量组成型纤维素酶至胞外，这些组成型纤维素酶能将纤维素底物水解成低分子量糖类，这些可溶性的低分子量糖类可以进入胞内，进而诱导更多纤维素酶基因的表达[4]。目前对组成酶的研究还较少，研究者们主要是对木酶[5]，青霉[6]研究，他们只是在2%葡萄糖的培养基中检测到纤维素酶活，或者对阻遏培养基中的调控因子进行研究，发现纤维素酶基因的启动子上存在抑制因子(ACE1、CER)等，对组成型内切葡聚糖苷酶基因的克隆研究还鲜有报道。

本实验的匍枝根霉是一株具有较高纤维素酶分泌的丝状真菌，目前已从匍枝根霉中克隆出3个内切纤维素酶基因，2个β-葡萄糖苷酶基因，并进行了原核和真核表达，对内切葡聚糖苷酶基因的结构进行分子生物学分析，并对其结构与功能进行初步研究。和大多真菌一样匍枝根霉的纤维素酶的合成受到葡萄糖的抑制，在以2%葡萄糖为唯一碳源时所产的纤维素酶定义为组成型纤维素酶[7]。本实验首次对匍枝根霉组成型内切葡聚糖苷酶基因进行了筛选、表达及酶学性质研究，有助于我们了解组成型内切葡聚糖苷酶的相关性质。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌种和试剂

匍枝根霉TP-02(由安徽工程大学可再生资源实验室保存)；大肠杆菌BL21(DE3)，质粒pET22；TaqDNA聚合酶，PCR产物纯化试剂盒，PCR试剂，mRNA提取试剂盒，AMV cDNA第一链合成试剂盒均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。SDS-PAGE所用试剂均为分析纯；SDS-PAGE所需储备液及缓冲液[8]；SDS洗脱液：10 mM Tris (pH值7.5)，5 mM巯基乙醇，20%异丙醇；蛋白复性液：50 mM醋酸钠(pH值4.8)，5 mM巯基乙醇，1 mMEDTA；0.1%的刚果红染色液：称取0.1 g刚果红溶解于100 mL重蒸水混匀后于室温保存。

1.1.2 培养基

组成酶培养基：葡萄糖 2%，硫酸铵 0.3%，硫酸镁 0.1%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钙 0.2%，吐温-80 0.025%，微量元素液。

LB培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠 1%，pH值7.0。

阳性克隆筛选培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠 1%，CMC-Na 1%，琼脂粉 2%，pH值7.0。

重组菌发酵培养基：CMC-Na 1%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠 1%，pH值7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活的测量

匍枝根霉组成型内切酶酶活的测量：把匍枝根霉种子液接种于组成酶培养基，在180 r/min，30℃条件下进行培养，每隔6 h取样进行酶活分析。

重组菌内切酶酶活的测量：将筛选的阳性克隆于37℃、150 r/min培养，每隔4 h取样测定内切葡聚糖苷酶酶活。

还原糖测定方法：DNS法测还原糖[9]。

酶活力测定方法：取适当稀释的酶液0.5 mL，加入l mL l%(w/v)的CMC-Na溶液(溶于pH值4.8的0.l mol/L HAc-NaAc缓冲液中)，50℃反应30 min后加入3 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后加水稀释到25 mL，在520 nm测OD值。

酶活定义：每分钟水解底物产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个活力单位(IU)。

1.2.2 匍枝根霉组成型cDNA文库的构建[10]

匍枝根霉在组成型培养基中发酵到30 h后离心得到菌丝体，采用Trizol裂解法来提取总RNA，mRNA的分离、cDNA精制及双链合成采用试剂盒法。将获得的双链DNA与含EcoRⅠ酶切位点的接头相连接，使用EcoRⅠ和NotⅠ酶对上述连接产物进行双酶切。并与同样双酶切的质粒pET22相连接，将上述连接产物用CaCl2方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得匍枝根霉组成型cDNA文库

1.2.3 匍枝根霉组成型cDNA文库的筛选

把重组菌涂布于含有抗性的LB平板上于37℃下静置培养24 h，后用刚果红染色，具有透明圈的克隆子即为所需的阳性克隆。

1.2.4 测序及序列分析

基因测序：委托上海生工生物工程技术服务有限公司；序列分析结合EditSeq及ProtParam软件预测；家族归属对比保守序列数据库。

1.2.5 重组酶酶学性质研究

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃反应温度下测定酶活，计算相对酶活，研究温度对内切葡聚糖苷酶酶活的影响。

分别在pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0条件下测定酶活，计算相对酶活，研究pH值对内切葡聚糖苷酶酶活的影响。

1.2.6 重组菌所分泌内切葡聚糖苷酶分子量大小的测定[6]

配制含0.1%CMC-Na的12%分离胶，粗酶液与上样缓冲液按比例混合后于75℃水浴10 min，离心后上样。待电泳结束后取出分离胶，先用考马斯亮蓝染色液染色，显出mark和发酵所产蛋白。在用SDS洗脱液洗脱2次，每次1 h。然后将胶用pH值4.8的HAc-NaAc缓冲液洗脱后放入复性液，4℃摇晃过夜，使蛋白复性。将复性后的凝胶浸泡于pH值4.8的HAc-NaAc缓冲液，在50℃反应1 h，使胶中复性后的内切酶和胶中的CMC-Na反应。用纯净水冲洗后，用0.1%的刚果红染色约20～30 min，然后用l mol/L的氯化钠溶液脱色至看出水解圈，最后用5%的醋酸冲洗终止反应[11]。透明圈即为重组菌分泌的内切葡聚糖苷酶在SDS-PAGE电泳胶上的位置，比照蛋白质Mark，测算出重组内切葡聚糖苷酶分子量大小。

2结果与讨论

2.1 匍枝根霉组成型内切葡聚糖苷酶酶活的时间曲线

匍枝根霉的组成型内切葡聚糖苷酶分泌在30 h达到最大为0.92 IU/mL，如图1所示。这和诱导条件下的匍枝根霉所产内切葡聚糖苷酶有较大差别[12]，匍枝根霉在诱导条件下在84 h达到最大酶活。根据匍枝根霉有的组成型内切酶的分泌特性，推断匍枝根霉具有组成型内切酶的分泌能力，为组成型cDNA文库的构建提供前提。

图1匍枝根霉组成型CMC酶活曲线

Fig 1 Activity of endoglucanse byRhizopusstoloniferconstitutive

图2总RNA的提取

Fig 2 Total RNA ofRhizopusstolonifer

2.2 组成型cDNA文库的构建

匍枝根霉在组成型培养基中发酵到30 h后离心得到菌丝体，采用Trizol裂解法来提取总RNA，如图2所示，可以用于mRNA的纯化，纯化后确保了无基因组DNA的污染，也保证了组成型文库的质量。cDNA精制和双链合成采用试剂盒法。将获得的双链DNA与含EcoRⅠ酶切位点的接头相连接，使用EcoRⅠ和NotⅠ酶对上述连接产物进行双酶切。并与同样双酶切的质粒pET22相连接，将上述连接产物用CaCl2方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得匍枝根霉组成型cDNA文库。

2.3 重组菌的筛选

将cDNA文库重组子涂布于含CMC的LB平板上，待形成单菌落后，用1%刚果红溶液染色1 h，后用5%的 醋酸溶液进行脱色固定染色圈，被内切葡聚糖苷酶分解后的羧甲基纤维素钠能和刚果红发生反应，到能够利用羧甲基纤维素钠的重组菌周围有透明圈，从而可以很便捷地筛选到阳性克隆。图4为重组zeg1和zeg2菌落，周围有透明圈。

图3 cDNA精制

Fig 3 Purification of cDNA

图4重组zeg1和zeg2筛选

Fig 4 The result of positive clone screening

图5 重组zeg1和zeg2的CMC酶活曲线

2.4 测序及序列分析

将阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得2个不同基因序列zeg1和zeg2，zeg1大小为1164 bp，zeg2大小为1251 bp。结合EditSeq软件及ProtParam的预测，结果显示zeg1基因共编码387个氨基酸，具体序列如下：MSSSSRNSTSLTAPATTRSSPAPPTSRPSGRTSPGSSRTTTWSSSTRVSTPLPPAVRTNTTTDNEYNTMDQTLVLDLNQAAIDGIRAAGATSQYIFAEGNSWSGAWTWADINDNMKALTDPQDKLVYEMHQYLDSDGSGTSGVCVSETIGAERLQAATQWLKDNGKVGILGEYAGGANDVCRTAIAGMLEYMGNNTDVWKGAVCGRLAPVADYMFSMSGPAAAYSGCWTCWRRIWVTAQFFILLLRGLVESEWRRIRSEGPLSYNIQEVGRRIRVRHSGNLSAFTPHDKIPPVDWARVSTTSSRIPPPSRLSSARAGTSSACSSCWKDWSRTRCRGRMTRPTCTISRRLVRASTPSWSRLIRSGGECNHGCRCPCHCRPSYYGRSCV

zeg1的分子式为C1814H2858N556O567S24，相对分子量为42.3 kD，理论等电点为9.42，属于碱性蛋白质，推测半衰期大于10 h。亲水性平均系数(GRAVY)为-0.459，结合ProtScale的分析结果，推断zeg1为可溶性蛋白。

结合EditSeq软件及ProtParam的预测，结果显示zeg2基因共编码416个氨基酸，具体序列如下：MSSSSRNSTSLTAPATTRSSPAPPTSRPSGRTSPGSSRTTTWSSSTRVSTPLPPAVRTNTTTDNEYNTMDQTLVLDLNQAAIDGIRAAGATSQYIFAEGNSWSGAWTWADINDNMKALTDPQDKLVYEMHQYLDSDGSGTSGVCVSETIGAERLQAATQWLKDNGKVGILGEYAGGANDVCRTAIAGMLEYMANNTDVWKGAVWWAAGPWWADYMFSMEPPSGPAYSGMLDVLAPYLGSAAAFLSSSNGRPPRHSSPLVARIFQRFRNSWLLFSNVCCPHPRYPQLMSAHNDRDRIQSVGRRVRHRHSGNLGAFTPHDKIPPVDWARVSTTSSRIPPPSRLSSARASTSSACSSSWKDWSRTRYRGRMPRPTCPISRRYVRASTPCCSRLISSGGDCNHGCRCPCHRTPSYLCTIV

zeg2的分子式为C1959H3046N594O607S24，相对分子量为45.4 kD，理论等电点为9.44，属于碱性蛋白质推测半衰期大于10 h。亲水性平均系数(GRAVY)为-0.505，结合ProtScale的分析结果，推断zeg2为可溶性蛋白。

经比对zeg1和zeg2有86%的相似性，有相似的催化活性区域。经CDD(保守序列数据库)分析，该蛋白归属于糖苷水解酶第5家族，对比PDB(蛋白结构数据库)中第五家族的关键催化残基，预测该两个蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199位的色氨酸(W)为该蛋白的催化残基，如图6。

图6 zeg1和zeg2蛋白关键催化残基示意图

图7重组菌的CMC酶最适作用温度

Fig 7 The optimum temperature of recombinant strains

图8重组菌的CMC酶最适作用pH值

Fig 8 The optimum pH of recombinant strains

2.5 重组菌内切葡聚糖苷酶酶活测定

将可编码zeg1和zeg2大肠杆菌BL21(DE3)于37℃、150 r/min培养，每隔4 h取样测定内切葡聚糖苷酶酶活。重组菌发酵曲线如图5所示 zeg1在重组菌发酵培养基中发酵20 h达到最大酶活0.422 IU/mL；zeg2在重组菌发酵培养基中发酵24 h达到最大酶活0.509 IU/mL。

2.6 重组菌粗酶酶学性质研究

图6和图7所示，zeg1和zeg2的最适反应温度为50℃，最适反应pH值都是5.0。这和其他内切酶重组菌所分泌的内切酶的最适温度和最适pH值相似[13-14]。

2.7 对重组菌所分泌内切葡聚糖苷酶分子量大小的测定

先对凝胶进行考马斯亮蓝染色，显出蛋白质条带和mark，洗脱凝胶后复性，使得凝胶中的内切葡聚糖苷酶与胶中的CMC-Na反应，用刚果红染色后出现透明圈如图所示，泳道1为重组菌zeg1的发酵液电泳图；泳道2为重组菌zeg2的发酵液电泳图，对比旁边M泳道的蛋白质mark，测算出zeg1和zeg2重组菌所分泌蛋白的分子量分别为55 kD、58 kD。

图9 重组zeg1和zeg2 CMC-SDS-PAGE电泳

泳道M为蛋白质mark：分子量从下到上为98、66.2、45、31、20、14.4 kD；泳道1为重组zeg1的发酵液电泳图：泳道2为重组zeg2的发酵液电泳图。

3 小结与讨论

本实验从匍枝根霉在组成型培养基中检测到内切葡聚糖苷酶酶活为线索，构建了组成型cDNA文库，成功分离出两株匍枝根霉组成型葡聚糖苷酶基因zeg1和zeg2；经比对zeg1和zeg2有86%的相似性，有相似的催化活性区域。经CDD(保守序列数据库)分析，该蛋白归属于糖苷水解酶第5家族，对比PDB(蛋白结构数据库)中第五家族的关键催化残基，预测该两个蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199位的色氨酸(W)为该蛋白的催化残基；通过对最适反应温度和最适反应pH值的探究发现和诱导型内切葡聚糖苷基因的重组菌分泌的内切酶相似[13]；通过CMC-SDS-PAGE电泳较准确的测算出重组zeg1和zeg2所分泌蛋白的分子量分别为55 kD、58 kD。

匍枝根霉分泌的组成型内切葡聚糖苷酶在30 h达到最大，而匍枝根霉在诱导条件下内切葡聚糖苷酶在84 h达到最大，组成和诱导型内切葡聚糖苷酶在分泌时间上有很大差异，组成型酶的分泌明显提前，这和前言中阐述的纤维素降解模型相一致。

本文虽对组成型内切葡聚糖苷酶基因的成功筛选和表达，但是酶活较低，这可能和大肠杆菌表达系统自身的缺陷有关，比如说缺乏使真核生物蛋白质复性的功能，缺乏修饰真核生物蛋白质的功能，其次内源性蛋白酶会降解一些异源蛋白等。

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